日粮添加尿素对育肥湖羊空肠...氨和尿素转运蛋白表达的影响_孙美杰.pdf
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1、 南京农业大学学报,():收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目();中央高校基本科研业务费专项资金()作者简介:孙美杰,硕士研究生。通信作者:申军士,副教授,研究方向为反刍动物营养与消化道微生物,:。孙美杰,郑文金,申军士,等 日粮添加尿素对育肥湖羊空肠菌群结构及氨和尿素转运蛋白表达的影响 南京农业大学学报,():,():日粮添加尿素对育肥湖羊空肠菌群结构及氨和尿素转运蛋白表达的影响孙美杰,郑文金,申军士,朱伟云(南京农业大学国家动物消化道营养国际联合研究中心 江苏省消化道营养与动物健康重点实验室动物科技学院消化道微生物研究室,江苏 南京)摘要:目目的的 本试验旨在探究日粮添加尿素对育肥湖
2、羊空肠发酵、菌群结构以及氨和尿素转运蛋白表达的影响。方方法法 将 只 月龄育肥公湖羊(约)随机均分为 个处理组,在饲喂基础日粮的基础上分别添加 (组)、(组)、(组)尿素。试验预饲期 周,正试期 周。试验结束每组随机选取 只屠宰,采集空肠内容物,测定发酵参数和定量总菌,并利用 测序分析空肠细菌组成;采集空肠上皮组织样品检测氨转运蛋白()、氨转运蛋白()和尿素转运蛋白()基因 表达。结结果果 与 组相比,和 组空肠氨态氮含量显著升高()。与 组相比,组总挥发性脂肪酸和乙酸含量显著降低,组丁酸和异戊酸含量相较于 组显著升高()。相较于 组,和 组的总菌数量显著升高()。测序结果显示,添加尿素并未影
3、响空肠 、和 指数(),分析结果显示各组间空肠细菌群落组成明显区分。添加尿素对湖羊空肠中细菌门水平相对丰度无显著影响,但细菌属水平相对丰度存在差异。各处理组主要优势菌属为 、和 ,其中 和 的相对丰度均在 组中最高。此外,组 和 的相对丰度相较于 组显著升高()。与 和 组相比,组空肠上皮 基因 表达水平显著上调();基因和 基因表达水平随尿素添加水平的升高逐渐降低,但差异不显著()。结结论论 日粮补充适宜尿素()可提高空肠内氨态氮含量,促进氮利用细菌的生长定殖,改善菌群结构。此外,添加尿素会影响空肠上皮 基因的表达,但不影响 基因和 基因的表达。关键词:湖羊;尿素;菌群结构;氨转运蛋白;尿素
4、转运蛋白中图分类号:文献标志码:文章编号:(),(,):(),(),()(),南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 (),()(),(),()()(),(),(),(),()(),:;尿素作为一种性价比高且氮含量(左右)丰富的非蛋白氮(),能够替代部分蛋白质饲料以降低饲养成本,因此被广泛应用于反刍动物饲粮中。前人在绵羊和山羊等的研究中发现,日粮补充尿素在很大程度上会影响瘤胃发酵参数、瘤胃微生物菌群组成和瘤胃上皮尿素转运蛋白的表达,但研究重点仅局限在瘤胃。尿素进入反刍动物瘤胃后首先被水解为氨,氨除了可提供瘤胃微生物合成微生物蛋白()所需的氮源外,过量氨还会通过瘤胃壁随血液转运至肝脏,在肝脏中通过
5、鸟氨酸循环合成内源性尿素,部分尿素会重新循环回胃肠道的各个部位,从而达到对尿素的回收再利用。在这一个过程中,尿素通过简单扩散进入胃肠道各部位的效率非常低,多数尿素返回胃肠道各部位主要依赖肠壁上皮的转运蛋白(如尿素转运蛋白)。通过尿素转运蛋白介导的尿素转运除了回到瘤胃外,还有一个重要部位就是小肠,而肝脏合成的尿素返回肠道的比例主要受日粮组成、粗蛋白或可发酵碳水化合物水平以及有机物消化率等因素的影响。等报道,给饲喂青贮牧草或黑麦干草的绵羊补饲尿素,分别有和 的尿素转移进入小肠。小肠除了可通过肠内细菌产生的脲酶直接分解尿素产生氨外,还可通过氨基酸的脱氨作用或谷氨酰胺酶途径产生氨,小肠内产生的氨可通过
6、自由扩散或肠上皮的氨转运蛋白转运入血并经门静脉入肝,从小肠吸收的氨可占门静脉吸收氨总量的 ,这反映了瘤胃后消化道部分对氨吸收利用的潜力。因此,小肠对反刍动物尿素氮的循环再利用以及氮代谢发挥着重要作用。目前关于日粮尿素供应的研究热点主要集中在瘤胃,而在小肠上的相关报道较少。基于小肠在反刍动物氮代谢和尿素循环中的重要作用,本试验旨在探究日粮添加尿素对湖羊空肠发酵参数、微生物菌群结构以及肠上皮氨转运蛋白和尿素转运蛋白表达影响,研究结果可为深入了解尿素在反刍动物体内的代谢利用机制提供更多的理论依据。材料与方法 试验设计与饲养管理将 只体重相近(约 )的健康公湖羊按照随机区组设计分为 个处理组,每组 栏
7、,每栏 只。组在饲喂基础日粮的基础上分别添加 (组)、(组)和 (组)的尿素。各组日粮能量水平相近,满足 育肥肉羊的生长需求(肉羊饲养标准:),但各组的粗蛋白水平不同。具体日粮组成和营养水平见本实验室前期 等的饲养试验。每日:和:等量饲喂,自由采食和饮水。试验包括 周适应期和 周正式期。样品采集试验结束的最后 ,每组随机选择 栏,每栏选 只湖羊于晨饲后 屠宰。统一收集空肠中段内容物,充分混匀后分装到离心管内。玻璃片刮取空肠中段上皮黏膜样品并分装于冻存管内,所有样品保存 第 期孙美杰,等:日粮添加尿素对育肥湖羊空肠菌群结构及氨和尿素转运蛋白表达的影响于 冰箱中用于后续指标的测定。空肠发酵参数测定
8、采样过程中,立即用 计(,)测定空肠内容物 值。参照 等的比色法,以氯化铵为标准品测定氨态氮的浓度。参照秦为琳的方法测定挥发性脂肪酸(,)含量并进行适当改进。样品加入适量双蒸水充分混合离心后,取 上清液加入 偏磷酸巴豆酸混合溶液后于 保存过夜。次日解冻后 离心 ,取上清液经 针式滤器过滤后,使用全自动气相色谱仪(,)进行测定。具体参数:前进样口,柱温 ,前检测器 ,分流比,载气为氮气。空肠微生物菌群定量及高通量测序 的提取 取 空肠解冻内容物于 离心管中,加 稀释并混匀离心,取上清液参照 等的方法加入 十六烷基三甲基溴化铵(,)混匀后转移至锆珠管中,经、酶、提取液和冰乙醇依次处理,提取空肠细菌
9、的,随后使用 分光光度计()检测其浓度(),确保所有样品 值为,保存于 备用。总菌定量 参照申军士等的方法构建 反应体系,包括:模板、上游引物、下游引物和 双蒸水。使用 仪(,)对空肠内容物中的总菌进行荧光定量 分析。其中以总菌的 基因构建质粒并以此作为模板制作总菌的定量标准曲线。细菌 扩增与 测序 空肠细菌的高通量测序由上海凌恩生物科技有限公司完成。选取细菌 基因的 可变区域作为目的片段对空肠细菌 进行 扩增。在扩增过程中引入不同样本的接头(碱基序列)和测序引物(:和:)。反应条件:;,个循环;。扩增完成后使用 蓝色荧光定量系统进行定量检测,按照测序要求进行 测序。将从 平台测序完成的所有原
10、始数据运用 软件进行片段拼接和质量过滤。过滤截去序列后端质量值低于 的碱基,过滤质控后 以下的序列,再根据双端序列间的重叠关系将成对序列拼接成一条序列,再使用 软件基于 算法识别并删除嵌合体,最终得到有效序列。以 的序列相似性将有效序列聚类成不同操作分类单元(),再将每个 的代表序列与 数据库进行比对、分类和注释。使用 软件对样品进行 多样性分析(包括 数、覆盖率、丰富度指数和多样性指数),再使用 语言基于 距离矩阵进行主坐标分析()。空肠相关氨和尿素转运蛋白 表达的测定按照总 快速提取试剂盒(,)说明书提取空肠上皮的,检测其 浓度()并保证 值为。将所有的 样品浓度稀释至 ,用反转录试剂盒(
11、,)将其反转成,随后以合成的 为模板,参照 试剂盒(,)说明书进行。反应条件:;,个循环;,。其中,扩增的氨转运蛋白基因(、)和尿素转运蛋白基因()引物由南京英骏生物科技有限公司合成。具体引物序列见表。采用 法计算各基因相对表达量。表 基因引物对序列 基因 引物对序列 ()产物长度 注:氨转运蛋白 基因 ;:氨转运蛋白 基因 ;:尿素转运蛋白 基因 ;:甘油醛磷酸脱氢酶基因 南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 数据分析将试验数据利用 软件进行分析,对空肠发酵参数和总菌定量数据进行单因素方差分析,对空肠细菌多样性指数和细菌门、属水平相对丰度进行非参数检验分析。采用 法进行多重比较,显著性水平定
12、为。结果与分析 日粮添加尿素对育肥湖羊空肠发酵参数的影响由表 可知:与 组相比,和 组的空肠氨态氮含量显著升高(),而 值虽有所降低但差异不显著();与 组相比,组的总挥发性脂肪酸和乙酸含量显著降低;组丁酸和异戊酸含量相较于 组显著升高();空肠各组间丙酸、乙酸 丙酸、异丁酸和戊酸含量无显著差异()。表 尿素添加对育肥湖羊空肠发酵参数的影响 项目处理 标准误 值 值 氨态氮含量()总挥发性脂肪酸含量()乙酸含量()丙酸含量()乙酸 丙酸 异丁酸含量()丁酸含量()异戊酸含量()戊酸含量()注:)、表示尿素添加量分别为、。,):表示未检测到 )同行数据肩标不同小写字母表示差异显著()。,()。下
13、同。日粮添加尿素对育肥湖羊空肠细菌多样性及组成的影响 日粮添加尿素对育肥湖羊空肠细菌菌群 和 多样性的影响 如表 所示:基因覆盖空肠 以上的细菌群落,说明测序结果能代表样本中微生物菌群的真实情况。多样性分析结果表明,各组间空肠细菌的 、和 指数均无显著差异(),说明添加尿素并未影响育肥湖羊空肠内细菌菌群的丰富度和多样性。分析结果显示:各组空肠细菌呈现区域性聚集,且组间明显区分开(:,;:,),说明不同尿素剂量处理组间的空肠细菌菌群组成存在差异(图)。表 尿素添加对育肥湖羊空肠细菌菌群 多样性的影响 项目处理 标准误 值 数 指数 指数 香农指数 辛普森指数 覆盖率 日粮添加尿素对育肥湖羊空肠细
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