钛合金支架——明胶复合载药体系的制备及其抗菌性研究_陈雅婧.pdf
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1、广西医科大学学报JOURNAL OF GUANGXI MEDICAL UNIVERSITY2023 Jan;40(1)钛合金支架明胶复合载药体系的制备及其抗菌性研究*陈雅婧1,梁腾月1,陈智敏1,张羽1,覃惠思1,欧海龙1,伍燕新1,孙健1,雷声远2,陈泉志1(1.广西医科大学基础医学院,南宁530021;2.广西大学资源环境与材料学院,南宁530004)摘要目的:探究提高钛合金骨植入材料的抗菌性及生物相容性的有效方法。方法:本文以3D打印的多孔钛合金为支架,将负载有庆大霉素的明胶填充于其中以制备复合骨植入材料;通过红外吸收光谱、水溶性及体外药物释放测试评价不同载药量对明胶稳定性的影响;利用细
2、菌黏附、细菌活性以及抑菌圈实验分析该复合材料的抗菌性能;采用细胞活性实验评价该材料的生物相容性。结果:不同载药量下明胶的耐水性均达到6 d,药物释放效应可维持到明胶完全溶解;载药量的提升能更有效地抑制大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的生长,在载药量为8 mg/mL的情况下,两种细菌的抑菌圈最大;细胞毒性分析发现不同载药量对成骨细胞的活性无显著影响(P0.05)。结论:此复合骨植入体材料具有良好的体外抑菌性能及生物相容性。关键词钛合金支架;明胶;庆大霉素;抗菌;生物相容性中图分类号:TB332文献标志码:A文章编号:1005-930X(2023)01-0079-07D
3、OI:10.16190/ki.45-1211/r.2023.01.013Preparation and antibacterial properties of composite drug loading system of titanium alloystent and gelatinChen Yajing1,Liang Tengyue1,Chen Zhimin1,Zhang Yu1,Qin Huisi1,Ou Hailong1,Wu Yanxin1,Sun Jian1,LeiShengyuan2,Chen Quanzhi1.(1.School of Basic Medical Scienc
4、e,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.School of Resources,Environment and Materials,Guangxi University,Nanning 530004,China)AbstractObjective:To improve the antibacterial properties and biocompatibility of titanium alloy implant ma-terials.Methods:In this paper,a composite bone implant
5、 material was prepared by using 3D printed porous tita-nium alloy as a stent filled with gelatin containing gentamicin.The effects of different drug loadings on gelatinstability were evaluated by infrared absorption spectrum,water solubility and in vitro drug release experiments.The antibacterial pr
6、operties of the composite were analyzed by bacterial adhesion,bacterial activity and inhibi-tion zone experiments.The biocompatibility of the material was evaluated by cell viability experiments.Results:The water resistance of the different drug-loaded composite materials reached 6 days,and the drug
7、 release effectcould be maintained until the gelatin was completely dissolved.The increase of drug loading had better antibacte-rial activity to E.coli and S.aureus,and the inhibition zone of the two bacteria was the largest at 8 mg/ml.Cyto-toxicity analysis showed that the activity of osteoblasts w
8、as not significantly affected by different drug loadinglevels(P0.05).Conclusion:It is considered that the composite bone implant material has good antibacterialproperties and biocompatibility in vitro.Keywordstitanium alloy stent;gelatin;gentamicin;antibacterial;biocompatibility*基金项目:国家自然科学基金资助项目(No
9、.21506040);广西再生医学重点实验室开放课题资助项目(No.桂再重开202004);广西高校中青年教师科研基础能力提升项目(No.02601221003X)通信作者,雷声远,E-mail:;陈泉志,E-mail:quanzhi_收稿日期:2022-11-02细菌感染是植入术后的难题,而钛合金优异的生物相容性难以抵抗细菌在其表面黏附、繁殖1-3。据临床分析,植入体手术易感染革兰氏菌,如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等4-6。庆大霉素是我国自主研发的广谱抗生素,对革兰氏菌有优异的抑制效果7-8。负载庆大霉素进行局部给药的抑菌性效果 79广西医科大学学报2023 Jan;40(1)得到了实验验证,
10、采用水凝胶、骨水泥、聚乳酸及蛋白类材料构建载药控释系统,并可调节其微结构优化抑菌9-12。明胶是胶原的水解产物,存在细胞结合位点,具有良好的生物活性13-14。然而,明胶的机械性能较差,限制了其在骨组织的进一步应用。钛金属及其合金具有优异的理化性和生物相容性而被广泛用于临床的硬组织植入体15-16。为了提高明胶材料的强度,并降低钛合金的弹性模量并提高受体组织的结合力,构建多孔仿生结构是有效的方法。3D打印技术具有高效性和个体化等优势,已成为医用材料的研究热点17-18。目前,明胶结合3D打印构建载药钛合金复合材料的生物相容性研究尚少,需要进一步研究。本研究通过3D打印技术制备多孔的钛合金植入体
11、,将负载有庆大霉素的明胶进行填充得到载药复合植入体,对不同载药量的缓释规律、体外抑菌及生物相容性进行分析,为骨植入材料进行局部抑菌提供理论基础。1材料与方法1.1复合材料的制备本实验材料采用的TA1钛粉末购于西安铂力特增材技术股份有限公司,材料成分为:Fe0.25,C0.10,N0.03,H0.015,O0.15,Ti99.45%。多孔骨架样品是采用YLM-120型3D激光打印机(江苏永年激光成形技术有限公司)制备。利用Rhinoceros 5进行样品模型设计,样品的微孔孔型为正八面体,直径10 mm,厚度2 mm,孔隙率65%。制备参数:激光功率100 W、扫描速度80 mm/min,宏观照
12、片如图1所示。样品用75%乙醇超声清洗,在121、0.12 MPa下高压灭菌30 min,晾干备用。图1钛合金3D打印样品实验所用的明胶购自北京Coolaber科技公司,处理方法如下:称取适量明胶于锥形瓶,在50 水浴溶解后加入三蒸水将其成浓度调为12%;在明胶溶液中加入庆大霉素(购自上海吉至生化科技有限公司),并在37 水浴中搅拌2 h,成载药量分别为0 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL、8 mg/mL;将3D打印样品浸泡入不同载药浓度的明胶溶液中并超声震荡30 min,使明胶充分填充在孔隙中;明胶冷却凝结后置于无水乙醇中静置脱水4 h;将脱水后的样品用二氧化氯对明胶进行交联,时间
13、为 12 h,温度为25。通过以上步骤,制备得到钛合金支架载药明胶复合骨植入体材料。1.2明胶的基团分析采用红外光谱对不同载药量的明胶膜进行基团分析,设备为Spectrum-two型红外光谱仪(德国布鲁克公司),测试波长范围:5004 000 nm。1.3明胶的抗溶解性能在无菌环境下,取尺寸相同的不同庆大霉素负载量(0 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL和8 mg/mL)的明胶膜浸泡于三蒸水中,每隔24 h进行拍照观察,并记录明胶膜溶解情况。1.4体外药物释放将各组复合骨植入体材料样品分别浸泡在PBS缓冲液,并在37 下进行100 r/min振荡。在0.5 h、1 h、2 h、8 h、
14、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h等各时间节点对庆大霉素浓度测试。在PBS浸泡液中添加浓度为3.010-4g/mL的磷钨酸钠溶液,混匀静置30 min后移至96孔板中,使用酶标仪(ELX800,Biotek Instruments,Inc.)测量249 nm处的吸光度值。采用PBS溶液加等量磷钨酸钠溶液为空白对照。1.5细菌培养采用革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)(广西医科大学基础医学院生物技术实验室)对复合骨植入体材料的抗菌性能进行评价。E.coli采用LB(Luria-Bertani)培养基,S.au
15、reus 采用 LB 培养基5%葡萄糖,均置于37 恒温培养箱培养。采用MTT法进行细菌活性检验。将细菌与不同复合骨植入体材料共培养24 h,经PBS 3次清洗后每孔加入1 mL浓度为0.5 mg/mL的MTT染色液,置于37 恒温培养箱培养1 h;将样品转移至新的孔中,每孔加入1mL DMSO溶液,在室温避光条件下以80 r/min震荡20 min;吸取200 L溶液至96孔板中,利用酶标仪测量490 nm波长处的吸光度值。以200 L DMSO作为空白对照。1.6细菌的黏附采用倒置显微镜(SGO-PH100,80深圳市深视光谷光学仪器有限公司)和扫描电子显微镜(SN-3400,日本日立)观
16、察细菌在复合骨植入体材料上的黏附和生长形态。将样品分为两组,经紫外照射灭菌30 min后分别置于24孔板中,一组加入处于对数生长期的E.coli菌液,另一组加入处于对数生长期的S.aureus菌液,并使菌液恰好盖过样品表面,然后置于37 恒温培养箱培养24 h。将样品用PBS对样品冲洗3次,分别加入1 mL 4%多聚甲醛对细菌进行固定12 h;使用PBS冲洗后分别利用浓度为30%、50%、70%、90%和100%的乙醇对样品表面细菌进行逐级脱水处理,每次10 min。脱水后,向24孔板中加入500 L叔丁醇溶液,处理10 min,待其挥发干燥后喷金处理进行扫描电子显微镜(scanning el
17、ectron microscope,SEM)观察。1.7抑菌圈实验配制2组LB固体培养基,分别吸取500 L处于对数生长期的E.coli菌液和S.au-reus菌液涂布于平板上,然后将复合骨植入体材料样品分别贴在2组平板中心,将平板置于37 恒温培养箱培养24 h,对抑菌圈进行观察与测量。1.8细胞的活性采用SD大鼠骨髓间充质干细胞(广西医科大学基础医学院生物技术实验室)进行细胞毒性实验。选取第三代细胞接种在复合骨植入体材料样品表面,于 37、5%CO2环境下培养24 h,将样品用PBS洗3次,每孔加入500 L事先配制好的含0.5%MTT(5 mg/mL)的DMEM低糖培养基,将24孔板放入
18、培养箱继续培养4 h。培养完毕后,吸弃培养基,每孔加入500 L DMSO,置于摇床上轻微振荡20 min,转移至96孔板中,采用酶标仪测量 490 nm 波长下的吸光度值。实验以相同DMSO含量的DMEM低糖培养基为对照组。1.9统计学方法所有实验均以每组重复3次进行。采用IBM SPSS Statistics 24.0对负载不同浓度庆大霉素的明胶复合材料的细胞毒性的结果进行统计分析,所得数据采用多样本方差分析,以P0.05为差异具有统计学意义。2结果2.1明胶的基团分析载药明胶的基团通过FTIR来进行分析,结果如图2所示。其中,3 2883 295cm-1对应N-H的伸缩振动以及氢键的振动
19、,3 0883 092 cm-l对应C-H的伸缩振动(酰胺A带),2 9382 940 cm-1为甲基的反称伸缩振动,1 6261 630 cm-l对应N-H的弯曲振动(酰胺带),1 5411 548 cm-1对应N-H弯曲振动和C-N的伸缩振动19。从图2可观察到载药后酰胺A带和带的强度明显增加,说明明胶和庆大霉素之间通过氢键发生了相互作用,并且随着载药量的增加而增强,此结果表明庆大霉素已成功负载在明胶内部。A:0 mg/mL;B:2 mg/mL;C:5 mg/mL;D:8 mg/mL。图2不同庆大霉素负载量明胶膜的红外吸收光谱2.2明胶的抗溶解性能明胶膜在三蒸水中的溶解性如图3所示,不同载
20、药量的明胶膜在三蒸水中浸泡的前5 d均可保持完整的形态。在第6天时,各组明胶膜开始膨胀、溶解,第7天时开始粉碎(明胶的溶解情况归纳在表1)。表明所制备的明胶膜在室温条件下抗溶解性能良好,庆大霉素的负载浓度对其水溶性影响不大。明胶的溶解过程可以逐渐释放药物,并暴露出 3D 打印支架材料的内部空隙。同时,明胶表面的细胞结合位点可引导骨细胞在钛合金支架内部生长,增大骨组织与植入体的结合力。表1不同庆大霉素负载量的明胶膜溶解情况时间/d0125678明胶膜溶解情况质地硬、外观透明的明胶膜明胶膜均吸水膨胀至原体积5倍左右明胶膜均保持完好,外观随时间的增长逐渐透明明胶膜均开始膨胀、溶解负载庆大霉素的明胶膜
21、(0 mg/mL、5 mg/mL和8 mg/mL)已破碎为颗粒状明胶,负载2 mg/mL庆大霉素的明胶膜完好4组明胶膜均破碎为颗粒状明胶陈雅婧,等.钛合金支架明胶复合载药体系的制备及其抗菌性研究 81广西医科大学学报2023 Jan;40(1)2.3体外药物释放药物体外释放测试是将不同复合骨植入体材料浸泡在PBS缓冲液中进行,负载不同庆大霉素量的明胶(未负载庆大霉素的样品除外)的药物释放曲线见图4。从图4中可以看出,庆大霉素在前期表现出明显的突释特性,可能是有部分庆大霉素负载于明胶表面,而交联后明胶表面的孔状结构增大了其接触面积,因此在浸泡前期迅速释放到溶液中20。庆大霉素的突释特性有利于该3
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