山楂叶配方颗粒与标准汤剂药效等效性研究 (1).pdf
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1、承 德 医 学 院 学 报JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL UNIVERSITY216Vol.40 No.3 2023山楂叶配方颗粒与标准汤剂药效等效性研究高静云1,李艳荣1,赵胜男1,杜义龙1,高 晗2,潘海峰1(1.承德医学院河北省中药研究与开发重点实验室,河北承德 067000;2.神威药业集团有限公司)摘要:目的 本研究在对山楂叶配方颗粒与标准汤剂的牡荆素葡萄糖苷、金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷和异槲皮素含量测定基础上,进行体外抗氧化活性等效性研究。方法 采用高效液相色谱法(HPLC)对山楂叶配方颗粒与标准汤剂中4种成分进行含量测定。利用过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内
2、皮细胞(HUVEC)氧化损伤,采用CCK8法考察3批山楂叶配方颗粒与标准汤剂的细胞毒性以及对细胞损伤后存活率的影响;利用试剂盒检测细胞中乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平,评价山楂叶配方颗粒及标准汤剂的抗氧化活性。结果 3批山楂叶配方颗粒及标准汤剂中4种成分的含量均无显著性差异,且对细胞无明显毒性。与模型组比,相同剂量的山楂叶配方颗粒和标准汤剂均能抑制细胞中 LDH、MDA(P0.05)的分泌,提升细胞中SOD(P0.01)的含量,且无显著性差异。结论 山楂叶配方颗粒和标准汤剂的主要化学成分含量基本一致,体外抗氧化活性具有等效性,为山楂叶配方颗粒的进一步研究
3、和开发提供了重要的理论依据。关键词:山楂叶;配方颗粒;标准汤剂;氧化应激;人脐静脉内皮细胞中图分类号:R242 文献标志码:A 文章编号:1004-6879(2023)03-0216-05中药配方颗粒是以中医药理论为指导,采用现代技术将中药饮片制成可供临床配方使用的颗粒剂1。作为传统中药饮片的补充与创新,具有免煎煮、服用方便、易于调剂等优点2,3。近年来,中药配方颗粒越来越受到人们的关注。然而,中药配方颗粒与中药汤剂在药理药效以及临床疗效上是否一致,一直备受争议。因此,开展中药配方颗粒与中药汤剂的药效等效性研究具有重要意义。山楂叶含有黄酮、有机酸等活性成分4-7。药理研究表明,山楂叶在心脑血管
4、、抗氧化等方面具有良好作用8。临床上多以片剂、胶囊剂等用于疾病的治疗9,10,但关于山楂叶配方颗粒的研究较少。因此,本文对山楂叶配方颗粒和标准汤剂的等效性进行研究,为山楂叶配方颗粒的开发和应用提供依据。1 材料与仪器1.1 细胞株人脐静脉内皮细胞(HUVEC),购于美国Sciencell公司。1.2 药物与试剂对照品(牡荆素葡萄糖,批号:20042305;牡荆素鼠李糖苷,批号:20042304;金丝桃苷,批号:19103001;异槲皮素,批号:18062702纯度98%),成都普菲得生物技术有限公司;胎牛血清、DMEM培养基,武汉普诺赛公司;MDA检测试剂盒,碧云天生物技术有限公司;SOD、L
5、DH检测试剂盒,南京建成生物工程研究所;维生素E(vitamin E),北京博奥拓达科技有限公司;山楂叶中试配方颗粒(S1S3),神威药业集团有限公司;山楂叶标准汤剂(S1S3),承德医学院中药研究所。1.3 仪器Agilent 1200高效液相色谱仪,美国安捷伦公司;JA5003上皿天平(千分之一),天津天马衡基仪器有限公司;AG225电子分析天平,瑞士梅特勒-托利多公司;KQ-700超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;HC-2062高速离心机,科大创新股份有限公司中佳分公司;FW100高速万能粉碎机,天津市泰斯特仪器有限公司。2 方法2.1 山楂叶配方颗粒与标准汤剂主要化学成分含量比较2
6、.1.1 色谱条件11 色谱柱品牌及型号:Agilent ZORBAX SB-C18,规格:4.6mm250mm,粒径:5m;柱温:30;流速:1.0mL/min;检测波长:340nm;进样体积:10L。流动相:0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)-四氢呋喃(D),洗脱程序见表1。资助项目:河北省省级科技计划资助项目(20372507D);河北省科技厅“技术创新引导专项-科技工作会商”项目(2020);河北省高校重点学科建设项目(冀教高 2013 4)*通讯作者Vol.40 No.3 2023承 德 医 学 院 学 报JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL UNIVERSITY217
7、表1 流动相梯度洗脱系统时间(min)A(%)B(%)D(%)09244159064228612239841424582144507125460712546509647009642.1.2 供试品溶液的制备 精密称量0.5g山楂叶配方颗粒及标准汤剂,置于具塞三角瓶中,加入50mL的60%甲醇,密封称定。超声提取(40KHz,700W),恢复室温后再次称定,60%甲醇补足失重。0.45m滤膜过滤,即得。2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取适量牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和异槲皮素对照品,甲醇溶解、定容,即得浓度分别为1.018mg/mL、1.015mg/mL、1.067mg/mL、
8、1.037mg/mL、0.4132mg/mL的对照品储备液。取适量各对照品储备液,置于容量瓶中,以50%甲醇溶解、稀释,即得每1mL中含有牡荆素葡萄糖苷80.2g、牡荆素鼠李糖苷115.8g、金丝桃苷35.3g和异槲皮素12.4g的混合对照品溶液。2.1.4 线性关系 按照“2.1.1”色谱条件,测定了不同浓度水平对照品溶液中各色谱峰的峰面积,得到牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和异槲皮素的回归方程分别为Y=11.237X-0.9696(R2=1),Y=1.237X-0.9696(R2=1),Y=11.892X-1.8951(R2=1),Y=20.33X-10.354(R2=1)。线性
9、范围分别为3.17203g/mL,5320g/mL,2.11134.81g/mL和0.9761.98g/mL,线性关系良好。2.1.5 样品测定 按照“2.1.1”条件下的色谱条件,在高效液相色谱仪设定上样体积为10L,测定并记录高效液相色谱图。将山楂叶配方颗粒与标准汤剂的高效液相色谱图与混合对照品的图谱进行比较。根据各对照品的保留时间和峰面积,计算配方颗粒与标准汤剂中牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和异槲皮素4个化学成分的含量,比较其化学成分的差异。结果见表2。表2 山楂叶配方颗粒与标准汤剂中牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、金丝桃苷和异槲皮素含量表(%)配方颗粒含量标准汤剂含量牡荆素
10、葡萄糖苷牡荆素鼠李糖苷金丝桃苷异槲皮素牡荆素葡萄糖苷牡荆素鼠李糖苷金丝桃苷异槲皮素S10.70751.31390.24600.1334S10.69761.32270.25340.1287S20.70181.31220.24830.1345S20.68601.33040.25120.1277S30.68951.32510.24830.1289S30.67911.32280.24940.1260平均值0.70001.31710.24750.1323平均值0.68771.32530.25130.1275SD0.00920.00700.00130.0030SD0.00960.00440.00200.0
11、014P0.18700.16000.05200.0640P0.18700.16000.05200.0640表中P值为山楂叶配方颗粒与标准汤剂对应成分的组间ANOVA计算结果2.2 山楂叶配方颗粒与标准汤剂抗氧化应激活性的比较2.2.1 细胞培养与药物配置 取对数生长期的细胞,用含有10%的胎牛血清、1%的青链霉素的DMEM培养液,置于37,5%CO2的培养箱中培养2448h传代一次。分别精密称取相当于山楂叶2.0mg的配方颗粒(n=3)与山楂叶标准汤剂(n=3),DMSO溶解,配置成10g/L的储备液,置于4冰箱内保存,备用,使用时用DMEM培养液稀释。精密称取10mg维生素E,蒸馏水溶解,置
12、于4冰箱内保存,备用,使用时稀释成浓度为25g/mL。2.2.2 实验分组及给药 取对数生长期的细胞,用DMEM培养液将细胞稀释为6105/mL的密度,以每孔100L接种于96孔板,5个复孔。另取细胞原液稀释为1105/mL,以每孔2mL接种于6孔板中,3个复孔。并置于37,5%CO2的培养箱中培养。贴壁24h后待HUVEC细胞达80%以上进行实验。将细胞随机分为正常组、模型组(H2O2)、阳性药组(vitamin E)及给药组。按分组加入适量药物后置于37,5%CO2培养箱中孵育。2.2.3 建立HUVEC 细胞氧化损伤模型:按“2.2.2”项下方法接种细胞于96孔板,贴壁24h。将孔内液体
13、换为无血清的高糖培养液,设空白对照组:加入DMEM培养液;不同浓度H2O2模型组:加入终浓度分别为100mol/L、200mol/L、400mol/L、600mol/L、800mol/L和1000mol/L的H2O2,放于培养箱中培养3h,用CCK8法筛选出建立氧化损伤模型最合适的H2O2浓度。2.2.4 山楂叶配方颗粒与标准汤剂作用时对HUVEC细胞承 德 医 学 院 学 报JOURNAL OF CHENGDE MEDICAL UNIVERSITY218Vol.40 No.3 2023的影响 按“2.2.2”项下方法接种细胞于96孔板,贴壁24h。除去细胞培养液,正常组每孔加入100L DM
14、EM培养液,给药组分别加入100L的浓度的山楂叶配方颗粒(50g/mL、100g/mL、200g/mL、400g/mL和800g/mL)与标准汤剂(50g/mL、100g/mL、200g/mL、400g/mL和800g/mL),置于培养箱中培养24h。用CCK8法测定出不同浓度的山楂叶配方颗粒与标准汤剂对HUVEC细胞的影响,实验重复3次。2.2.5 山楂叶配方颗粒与标准汤剂对氧化损伤后 HUVEC细胞的影响 按“2.2.2”项下方法接种细胞于96孔板,贴壁24h。除去细胞培养液,除正常组外,其他各组每孔加入100L H2O2(600mol/L),孵育3h,获得H2O2氧化损伤模型。除去培养液
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