草酸青霉16β-葡萄糖苷酶的异源表达_张念.pdf
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1、第 卷 第 期 年 月江西师范大学学报(自然科学版)()收稿日期:基金项目:国家自然科学基金(,),江西省自然科学基金()和江西师范大学博士科研启动基金()资助项目通信作者:赵喜华(),男,江西玉山人,教授,博士,主要从事酶工程和合成生物学研究:张念,林颖颖,祁可丹,等 草酸青霉 葡萄糖苷酶的异源表达 江西师范大学学报(自然科学版),():,(),():文章编号:()草酸青霉 葡萄糖苷酶的异源表达张 念,林颖颖,祁可丹,王国平,欧阳蓓,赵喜华(江西师范大学生命科学学院,江西 南昌)摘要:为探究真核菌株草酸青霉 的 葡萄糖苷酶()在不同宿主中的异源表达情况,该文通过基因克隆技术,将 基因分别与、
2、载体进行连接,转化到毕氏酵母 或大肠杆菌 ()上,筛选阳性克隆子,比较并分析其表达情况 结果表明:未能成功电转到毕氏酵母 上;将 转化到大肠杆菌 上,使用最终物质的量浓度为 的 和质量分数为 的乳糖在 下诱导可实现高水平表达,但极易形成包涵体且无活性 为了消除包涵体的影响,在相同条件下将 的 端加入 分泌信号肽,经 检验,有高水平可溶性表达,但无活性;将 电转到 上,筛选阳性克隆子并接种到含 培养基的摇瓶中,结果表明:上清液蛋白质量浓度达到 ,且有活性 真核来源的 基因适合于真核宿主表达关键词:葡萄糖苷酶;异源表达;酶活中图分类号:文献标识码:引言碳水化合物是地球上分布最广、储量最丰富的可再生
3、生物质资源,大量焚烧碳水化合物会造成环境污染和资源浪费 因此,将多余的碳水化合物转化为有用的生物燃料和化学物具有重要的研究价值 纤维素是自然界分布最广、含量最多的一种多糖,占植物界碳含量 以上 水解纤维素的酶包括,内切葡聚糖酶()、纤维二糖水解酶()和,葡萄糖苷酶()可将长链纤维素水解为纤维糊精和低聚糖,释放纤维二糖单位,将纤维二糖转化为葡萄糖 通常被最终产物葡萄糖抑制,使得纤维二糖的水解成为一个限速步骤 纤维二糖的积累会抑制 和 的作用,减缓整个降解过程 因此,获得大量性质优良的 对加速这一过程具有重要意义本课题组筛选了一种新的快速生长的野生真菌 草酸青霉,它能分泌淀粉酶、纤维素酶和半纤维素
4、酶,研究了草酸青霉 的 的最适温度、最适 值、酸碱耐受性等,发现 具有较差的有机酸耐受性 已通过同源建模获得 维结构,也进行了分子对接,但是精确度不如 衍射的 维结构 此外,的催化机制还有待进一步地阐释 想要解决这些问题,关键是要获得 的蛋白晶体 基于 衍射等技术的结构解析,根据结构决定功能原理,可进行定点突变,以获得耐受有机酸的 突变体,为其应用于纤维素乙醇生产奠定基础 所有这些过程的前提是获得高浓度、高纯度的 蛋白 因此,本文从提高蛋白浓度入手,通过多种手段进行蛋白表达的对比分析 实验材料与方法 实验材料 基因来源于本实验室,载体、载体、载体、毕氏酵母 分别由清华大学李春教授和华东理工大学
5、魏东芝教授赠送 大肠杆菌()购自索来宝,胶回收和质粒提取试剂盒分别购自 和 公司,酶购自 公司,连接酶和各种限制性核酸内切酶购自 公司,离子交换柱购自天地人和公司,氨苄西林、卡那霉素、氯霉素、柠檬酸、二水合柠檬酸三钠、氯化钠、乳糖、考马斯亮蓝 等均为分析纯试剂,它们购自国药集团药业股份有限公司 实验方法 基因的获取从 基因序列,根据、载体酶切位点,使用 软件设计引物,引物序列如表 所示,再使用 连接酶将双酶切基因和相应载体进行连接表 与不同载体相连的 基因引物表达系统引物名称引物序列()划线处酶切位点酵母 甲醇诱导型 酵母 组成型 大肠杆菌 诱导型 、酶活性的鉴定 在碱性条件下,葡萄糖苷酶以水
6、杨苷为底物,在 下反应.,可产生葡萄糖,还原糖与二硝基水杨酸()会发生氧化还原反应,生成 氨基硝基水杨酸,该产物在煮沸条件下呈棕红色,根据在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理,在 处测定其吸光度在 和 连接并转化到毕氏酵母 中表达时,目的蛋白分泌在胞外,只需在培养后离心取上清液鉴定即可 当转化到大肠杆菌 中表达时,目的蛋白分泌在胞内,只有在诱导后超声破碎离心取上清液才能鉴定 重组载体的表达)重组菌的表达 重组载体经 线性化后电转到毕氏酵母 上,在含博莱霉素的 平板上筛选阳性克隆子,将阳性克隆子接种到 液体培养基中于 和 的转速下培养 ,离心取上清液测酶活,并进行 蛋白电泳鉴定)
7、重组菌的表达 将含有 重组载体的阳性克隆子接种到 培养基中,在 和 条件下培养 ,再加入最终物质的量浓度为 的 和最终质量分数为 的乳糖,于 和 条件下过夜诱导,在破碎细胞后取上清验证酶活,并进行 蛋白电泳鉴定在 的 端引入 分泌信号肽序列,含有 重组工程菌的表达操作步骤同上 蛋白纯化使用 离子交换柱和 液相色谱分析仪进行蛋白纯化 蛋白酶液在 转速下离心 ,用透析袋固装好上清液并放在装有 值为 、物质的量浓度为 的柠檬酸缓冲液的烧杯中,用保鲜膜密封好放在 冰箱中透析 ,期间最少换 次缓冲液 之后收集液在 转速下离心 ,上清液使用孔径为 的微孔滤膜抽滤,平衡液与洗脱液也需进行同样处理 使用 不含
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