lncRNA_HCG18靶...增殖、迁移和侵袭的机制研究_刘文斌.pdf
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1、收稿日期 修回日期 作者单位 湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院 脊柱外科,作者简介 刘文斌(),男,主治医师文章编号()基础医学 靶向 轴促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的机制研究刘文斌,李艳兵,周焱涛摘要目的:探讨长链非编码()人类白细胞抗原复合体()对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及可能机制。方法:收集 例骨肉瘤组织及对应瘤旁组织,法检测组织中 和 表达,相关分析评价骨肉瘤组织中 和 表达的相关性。体外培养骨肉瘤 细胞,分别转染、共转染 与 或 与 后,采用 法和克隆形成实验检测细胞增殖,划痕实验和 分别检测细胞迁移和侵袭,蛋白印迹法检测细胞中 蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验验证 和
2、及 和 调控关系。结果:骨肉瘤组织中 表达量高于瘤旁组织(),而 表达量低于瘤旁组织()。相关分析结果显示,骨肉瘤组织中 与 的表达呈负相关关系(,)。下调 或上调 后,细胞吸光度值和克隆形成数降低(),划痕愈合率和细胞侵袭数降低()。靶向负调控,而 是 靶基因。下调 逆转下调 对骨肉瘤 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。上调 可逆转上调 对骨肉瘤 细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论:在骨肉瘤组织中表达升高,其可能通过靶向 轴促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。关键词 骨肉瘤;人类白细胞抗原复合体;轴;细胞增殖;迁移;侵袭中图法分类号 文献标志码 :,(,):()(),:,:,(),()(,),(
3、),(),:,;蚌埠医学院学报 年 月第 卷第 期 骨肉瘤是好发于儿童及青少年的骨组织恶性肿瘤,易复发和转移,预后较差。目前,骨肉瘤发病机制尚未明确。研究显示,骨肉瘤的发生发展与癌基因的异常激活及抑癌基因的失活有关,探究骨肉瘤中异常表达的基因分子,可为其治疗提供分子靶点。长链非编码 ()和微小()是两类小分子非编码,且 可靶向 进而调控 靶基因的表达,参与肿瘤细胞增殖和凋亡等生命活动,为肿瘤的治疗提供了分子靶点。人类白细胞抗原复合体(,)属于一种,其在胃癌、肝癌、鼻咽癌和肺腺癌等肿瘤中表达升高,促进这些肿瘤的发展进程。靶基因软件预测显示,可能靶向结合,而叉头框蛋白(,)可能是 的靶基因。低表达
4、与骨肉瘤进展过程中的生理病理学活动密切相关,通过上调 可增强体外骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力,延缓肿瘤进展。是叉头框家族成员之一,参与心肌细胞发育、免疫 细胞分化等过程。有报道称,在骨肉瘤组织中表达升高,促进骨肉瘤增殖和转移。本研究检测了骨肉瘤组织中 的表达,然后以骨肉瘤 细胞为研究对象,轴为切入点,探讨 对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。现作报道。资料与方法 一般资料 收集 年 月至 年 月在我院确诊并行手术治疗的骨肉瘤病人 例瘤组织及对应的瘤旁组织,液氮保存。其中女 例,男 例;年龄 岁,平均()岁。排除标准:合并其他恶性肿瘤;合并心、肝、肾等重要脏器功能障碍。组织样本取材经病人
5、或家属同意,研究经本院伦理委员会批准。细胞和试剂 细胞株(中国科学院上海细胞库);抽提试剂盒、逆转录试剂盒和 试剂盒(大连宝生物);培养基、双荧光素酶活性检测试剂盒、二喹啉甲酸()蛋白检测试剂盒(北京索莱宝);胎牛血清()(浙江天杭生物科技股份有限公司);试剂盒(美国 公司);引物、小干扰()、乱序无意义阴性序列()、抑制剂()及抑制剂阴性序列()、和 的野生型质粒(、)及突变型质粒(、)、模 拟 物()、模拟对照序列()、过表达载体()、空载体()(上海生工);兔 抗 人 和 甘 油 醛磷 酸 脱 氢 酶()单克隆抗体(美国 公司)。方法 法检测 和 表达 将收集的新鲜组织样本在液氮保护下进
6、行研磨,用 抽提试剂提取组织总。然后将 逆转录生成,并行 扩增。扩增程序:;,共 个循环。引物序列:上游 ,下游 ;上游 ,下游 ;上游 ,下游 ;上游 ,下游 。法计算 相对于内参、相对于内参 的表达水平。细胞培养和转染 将 细胞在超净工作台中复苏,加含 的 培养基,于 、体积分数、湿度 的培养箱中培养。取对数期 接种于 孔板中(个 孔),用 脂质体法,分别转染 (组)、(组)、(组)、(组)、共转染 与(组)、与(组)、与(组)、与 (组)。转染 后,更换为含 的 培养基,再培养,法检测细胞中 或 表达验证转染效果,方法同 ,并收集细胞备用。同时设置对照组(组),细胞用常规培养基培养,不进
7、行任何转染操作。法检测细胞增殖将各组细胞接种于 孔板中(个 孔),培养 后,加 试 剂。孵 育 ,用 酶 标 仪(,)测吸光度值。克隆形成实验将各组细胞接种于 孔板中(个 孔),每 换一次培养基。培养 后,弃培养基。用多聚甲醛固定、结晶紫染色后,显微镜观察,对超过 个细胞的克隆记数。划痕实验检测细胞迁移将各组细胞接种于 孔板中(个 孔),培养 后,弃培养基。用 移液器枪头在培养板底部平行于中轴线划两条平行线,并用 清洗掉划痕间细胞,测量划痕间距,记为。更换为新鲜培养基,培养 后,再次测量细胞间间距,记为。划痕愈合率()()。法检测细胞侵袭将 小室置于 孔板中,铺 基质胶,自然晾干。在上室中加含
8、 个细胞的细胞悬液,下室加 培养基。培养 后,随后弃培养基,用多聚甲醛固定、结晶紫染色。将基质胶下层置于倒置显微镜下观察。随机取 个视野,对视野下的细胞记数。免疫印迹法检测 蛋白表达 将各组细胞接种于 孔板中(个 孔),培养 后,用 试剂提取细胞中总蛋白,并用 定量。将定量后的蛋白溶液行 电泳,然后转至 膜,并用 脱脂奶粉封闭 。先分别用()和()一抗孵育液在 冰箱中将封闭后的蛋白条带孵育过夜,洗膜后,再用山羊抗兔二抗()孵育液在 摇床中孵育 。最后加显影液避光显影,凝胶系统曝光拍照,软件分析 相对于 的表达量。双荧光素酶报告基因实验 靶基因预测软件显示,与、与 的核苷酸序列分别存在连续结合位
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