草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟_郭小雷.pdf
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1、 ,化学与生物工程 基金项目:福建省中科院 院省合作重大项目()收稿日期:作者简介:郭小雷(),男,安徽阜阳人,博士,工程师,研究方向:蛋白质工程,:。:郭小雷草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟化学与生物工程,():,():,草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟郭小雷(福州科宏生物技术开发有限责任公司,福建 福州 )摘要:以来源于草生欧文氏菌()的酪氨酸酚裂解酶()为目的基因,通过易错 定向进化技术构建突变体文库,利用高通量筛选方法获得了比酶活提高的突变体 和 ,再通过定点突变得到突变体 。经 摇 瓶 发 酵 培 养 发 现,突 变 体 比 野 生 型 的 比
2、 酶 活 提 高 了 ;酶学性质研究结果表明,突变体 的最适温度仍为,最适 值从 升至,热稳定性、稳定性均得到明显提高;结构模拟结果表明,突变体 的三维结构无明显变化,突变位点附近氢键和表面电势有所变化。体外定向进化技术能有效提高 的催化效率,对酶法生产酪氨酸具有重要应用价值。关键词:易错 ;定向进化;草生欧文氏菌;酪氨酸酚裂解酶;酪氨酸中图分类号:(.,.,):(),:;酪氨酸酚裂解酶(,)是一种磷酸吡哆醛(,)依赖型裂解酶。具有广泛的底物特异性,可以催化 酪氨酸发生,消除反应生成丙酮酸、苯酚和氨,该反应是郭小雷:草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟 年第期 可逆的;可以催化
3、 酪氨酸和其它几种 氨基酸发生,消除反应;还可以催化酪氨酸、甲基半胱氨酸和一些相关氨基酸的取代反应;同时,对一些氨基酸包括丙氨酸具有消旋作用。目前,发现 多存在于肠杆菌属中,如大肠杆菌属、变形杆菌属和欧文氏菌属。随着研究的深入,近年来发现的 新的微生物来源及其应用越来越多,如气单胞菌()、克雷伯氏菌()、摩氏摩根氏菌()、弗氏柠檬酸杆菌()、中间柠檬酸杆 菌()、草 生 欧 文 氏 菌()和恶臭假单胞菌()等。目前,制备 酪氨酸效率最高、成本最低的酶转化法主要以苯酚、游离铵、丙酮酸或 丝氨酸为底物,以 为辅酶,通过 催化得到。因此,筛选或改造获得催化活性高、热稳定性好的 在酶转化法制备酪氨酸的
4、工业化应用中有着十分重要的意义。年,团队首次提出了酶定向进化的概念,即在目的基因中随机引入低频率突变,并定向选择所需性质的突变酶。定向进化技术包括定点突变、易错 和 重组等。定向进化技术不需要提前 知 道 酶 的 结 构、功 能 或 结 构 与 功 能 之 间 的 关系,为酶的改造提供了更为便捷的新途径。等 通过多次交替使用易错 、定点突变和 改组技术,使黑曲霉来源的植酸酶的活性和热稳定性都得到了大幅提升。在此,作者以来源于草生欧文氏菌的酪氨酸酚裂解酶()为目的基因,通过易错 定向进化技术构建突变体文库,利用高通量筛选方法及定点突变构建突变体,为酶法生产 酪氨酸的工业化应用奠定基础。实验 材料
5、与试剂大肠杆菌.()、表达载体 ();质粒 (),由基宇生物科技有限公司(常州)构建。限制性内切酶(、和 )、聚合酶、连接酶,公司(大连);柱式质粒 小量抽提试剂盒、异丙基硫代半乳糖苷()、单硫酸卡那霉素,生工生物工程(上海)股份有限公司;蛋白质 标准品、聚丙烯酰胺凝胶电泳()试剂盒,上海碧云天生物技术有限公司;磷酸吡哆醛(),浙江正硕生物科技有限公司;其它试剂均为进口试剂或国产分析纯。培养基种子培养基(,):胰蛋白胨 ,酵母提取物,(固体培养基添加的琼脂粉);用 氢氧化钠溶液调节 值至 ,高温灭菌 。发酵培养基(,):胰蛋白胨,酵 母 提 取 物 ,甘 油,;用 氢氧化钠溶液调节 值至 ,高
6、温灭菌 。易错 扩增 基因片段以质粒 ()为模板,扩增 基 因 片 段,设 计 上 游 引 物 :(划线部分为限制性内切酶 的酶切位点)和下游引物 :(划线部分为限制性内切酶 的酶切位点)。易错 扩增反应体系为:质粒 ()模板,上游引物 ,下游引物 ,聚合酶,加 补足。反应条件:预变性 ;变性,退火,延伸 ,个循环;延伸 。突变文库的构建将易错 扩增产物进行 琼脂糖凝胶电泳,选择目的条带进行切胶纯化回收,并以此为大引物,采 用 ()法对大引物全质粒进行 ,直接将突变后的 基因扩增至表达载体 ()上。反 应体系 为:质 粒 ()模板,易错 产物,高保 真 酶 ,加 补 足 。反应条件:预变性 ;
7、变性,退火,延伸 ,个循环;延伸 。向 产物中加入限制性内切酶 ,酶切消化原始模板,产物转化至.()感受态细胞中,涂布于 固体平板(),随机挑选单菌落进行菌落 ,验证转化子的阳性克隆概率。将不同反应条件下的易错 产物克隆至表达载体 (),并分别随机挑取 郭小雷:草生欧文氏菌中酪氨酸酚裂解酶的体外定向进化及结构模拟 年第期 个突变子进行测序,利用软件 比对测序结果并计算突变率,以确定最合适的 和 浓度。利用在最优易错 条件下得到的所有转化子构建突变文库。突变文库的高通量筛选从构建含有 个转化子的突变文库中挑取单克隆至含有 无菌 培养基的 孔板中,每孔个单克隆,、振荡培养,加入诱变剂 至终浓度为
8、,降温至 培养过夜,获得单克隆菌液,将 个 孔板命名为“母板”。每孔保留一半菌液冷藏,另一半离心弃上清,离心菌体于 冷冻过夜后用反应液重悬,反应体系 ,反应 ;离心 ,移取上清 至第块含有 水杨醛试剂、溶液的 孔板中,显色反应 后,加入 溶液终止反应,通过酶标仪测定每孔的 值。以 出 发 菌 株 转 化酪 氨 酸 情 况 为 对 照,值越高,表明丙酮酸剩余量越多,酪氨酸转化量越少,说明该突变子为负向突变;反之,为正向突变。再经过两轮复筛,分别筛选 值较低的 株、株相应“母板”上的单克隆菌液,每个单菌落做个平行,通过 发酵工艺对获得的正向突变株进行摇瓶发酵复筛,采用 法测定比酶活,确定比酶活提高
9、后再进行测序,确定突变位点。酶活的测定反应体系中依次加入 水、氯化铵、丙酮酸钠、亚硫酸钠、和 苯酚,搅拌使其溶解,用氨水调节 值至,通氮气;称取 冷冻菌,加入 缓冲液(值、)重悬,加入 至终浓度为 ,移至上述反应体系中,反应 后加入 硫酸,保温 ,使 酪氨酸充分溶解;取样,用 值 的磷酸溶液稀释 倍,采用 法测定 酪氨酸含量。酶活定义:反应生成 酪氨酸所需的酶量定义为一个酶活单位。色谱条件:色谱柱(,),流动相为 甲醇,波长为 ,柱温为,流速为 ,二极管阵列检测器()。结果与讨论 易错 条件的确定选择 梯度浓度()为、进行易错 实验,考察 浓度对易错 产物的影响,结果如图所示。:,浓度():、
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