东方百合LoABI1基因的克隆及表达分析.pdf
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1、西北植物学报,2 0 2 3,4 3(2):0 1 9 0-0 2 0 1A c t a B o t.B o r e a l.-O c c i d e n t.S i n.d o i:1 0.7 6 0 6/j.i s s n.1 0 0 0-4 0 2 5.2 0 2 3.0 2.0 1 9 0 h t t p:/x b z w x b.a l l j o u r n a l.n e t收稿日期:2 0 2 2-0 9-0 1;修改稿收到日期:2 0 2 2-1 2-1 8基金项目:国家自然科学基金(3 1 6 7 2 1 9 1);中央高校基本科研业务费专项(Y X 2 0 1 5-1 6
2、)作者简介:赵一燃(1 9 9 9-),女,在读硕士研究生,主要研究方向为花卉种质资源创新与育种。E-m a i l:1 4 4 9 9 6 1 2 8 3q q.c o m*通信作者:何恒斌,副教授,主要从事花卉种质资源创新与育种研究。E-m a i l:h e n g b i n h e_1 2 2 0b j f u.c n东方百合L o A B I 1基因的克隆及表达分析赵一燃,胡钧舒,朱云涛,孙婷婷,何恒斌*(花卉种质创新与分子育种北京市重点实验室,国家花卉工程技术研究中心,城乡生态环境北京实验室,教育部林木花卉育种实验室,北京林业大学 园林学院,北京 1 0 0 0 8 3)摘 要:
3、该研究以东方百合 索邦 为材料,采用 R T-P C R 扩增方法克隆A B I 1基因,对其进行了生物信息学分析,并采用实时荧光定量 P C R 检测其组织表达特性和低温处理过程及定植后的表达特征,以明确A B I 1基因 的功能特性,为解析百合A B A 信号转导途径及其调控低温解除休眠过程的机理奠定基础。结果表明:(1)成功克隆得到东方百合L o A B I 1基因,其编码序列长度为1 3 4 1 b p,共编码4 4 6个氨基酸;L o A B I 1氨基酸序列中含有1个蛋白磷酸酶 2 C(P P 2 C)保守结构域。(2)系统进化分析显示,L o A B I 1蛋白与水稻P P 2
4、C家族成员O s P P 2 C 0 6的同源进化关系最近,且与拟南芥A t A B I 1聚为一支,同属于P P 2 C基因家族中的A亚群。(3)亚细胞定位发现,L o A B I 1蛋白定位于烟草表皮细胞的细胞核和细胞质。(4)q R T-P C R荧光定量分析显示,L o A B I 1基因在百合茎生根、嫩茎、叶片及各花部组织中均有表达,且在幼嫩组织中表达量较高;L o A B 1 I基因在冷藏期间的表达量呈先升高后降低的趋势,并于 冷藏期第5周达到峰值,但在定植期间持续下降且保持较低水平。(5)经4 低温处理6 0 d的百合鳞茎在定植后1 4 2 8 d能发芽、2 8 4 8 d可见花
5、蕾,而不进行低温处理的鳞茎既不萌芽也不开花。研究推测,百合L o A-B I 1 基因可能在低温解除种球休眠过程中具有重要作用,L o A B I 1蛋白可能在百合A B A信号转导过程中发挥作用。关键词:东方百合 索邦;A B I1基因;克隆;基因表达中图分类号:Q 7 8 5;Q 7 8 6文献标志码:AC l o n i n g a n d E x p r e s s i o n A n a l y s i s o f L o A B I 1 i n L i l i u m O r i e n t a l H y b r i dZ HAO Y i r a n,HU J u n s h u
6、,Z HU Y u n t a o,S UN T i n g t i n g,HE H e n g b i n*(B e i j i n g K e y L a b o r a t o r y o f O r n a m e n t a l P l a n t s G e r m p l a s m I n n o v a t i o n a n d M o l e c u l a r B r e e d i n g,N a t i o n a l E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C e n t e r f o r F l o r i c u l t
7、 u r e a n d B e i j i n g L a b o r a t o r y o f U r b a n a n d R u r a l E c o l o g i c a l E n v i r o n m e n t,C o l l e g e o f L a n d s c a p e A r c h i t e c t u r e,B e i j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y,B e i j i n g 1 0 0 0 8 3,C h i n a)A b s t r a c t:I n t h i s s t u d
8、 y,A B I 1 g e n e w a s c l o n e d f r o m L i l i u m o r i e n t a l h y b r i d S o r b o n n e b y R T-P C R,a n d t h e b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s w e r e p e r f o r m e d.M e a n w h i l e,t h e q R T-P C R w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n p a t t e r
9、 n s o f L o A B I 1 i n l i l y a t d i f f e r e n t t i s s u e s a n d i n t h e p r o c e s s o f l o w t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t a n d a f t e r t r a n s p l a n t i n g,f o r c l a r i f y i n g t h e f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s o f L o A B I 1 g e n e a n
10、 d l a y a f o u n d a t i o n f o r t h e a n a l y s i s o f t h e A B A s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y a n d t h e m e c h a n i s m o f b r e a k i n g d o r m a n c y a t l o w t e m p e r a-t u r e i n l i l y.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t:(1)t h e L o A B I 1 g e
11、n e o f l i l y w a s c l o n e d s u c c e s s f u l l y.T h e c o d i n g s e-q u e n c e o f L o A B I 1 w a s 1 3 4 1 b p l o n g a n d L o A B I 1 e n c o d e d 4 4 6 a m i n o a c i d s c o n t a i n i n g a c o n s e r v e d p h o s-p h a t a s e 2 C(P P 2 C)d o m a i n.(2)P h y l o g e n e t
12、 i c a n a l y s i s s h o w e d t h a t L o A B I 1 w a s c l o s e s t t o O r y z a s a t i v a a n d c l u s t e r e d w i t h A t A B I 1,w h i c h i s a m e m b e r o f A r a b i d o p s i s t h a l i a n a P P 2 C g e n e f a m i l y,a n d b o t h o f t h e m b e l o n g t o P P 2 C A g r o u
13、 p.(3)T h e s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n r e s u l t s s h o w e d t h a t L o A B I 1 i s l o c a l i z e d i n t h e n u c l e u s a n d c y t o p l a s m o f t o b a c c o e p i d e r m a l c e l l s.(4)R e a l t i m e R T-P C R e x p r e s s i o n a n a l y s i s s h o w e d t h
14、 a t L o A B I 1 e x p r e s s e d i n s t e m r o o t,t e n d e r s t e m,l e a f,a n d f l o r a l o r g a n,a n d t h e e x p r e s s i o n l e v e l i s h i g h-e r i n t e n d e r t i s s u e s;T h e e x p r e s s i o n o f L o A B I 1 i n c r e a s e d a t f i r s t r e a c h i n g t h e p e a
15、 k a t t h e f i f t h w e e k o f c o l d s t o r a g e,a n d t h e n d e c r e a s e d d u r i n g c o l d s t o r a g e.F i n a l l y,i t r e m a i n e d a t a l o w-l e v e l d u r i n g c o l o n i z a t i o n.(5)T h e l i l y b u l b s t r e a t e d a t 4 f o r 6 0 d a y s c o u l d g e r m i
16、n a t e a t 1 4-2 8 d a y s,a n d t h e b u d s c o u l d b e s e e n a t 2 8-4 8 d a y s a f t e r t r a n s p l a n t i n g,w h i l e t h e b u l b s w i t h o u t l o w t e m p e r a t u r e t r e a t m e n t n e i t h e r g e r m i n a t e d n o r f l o w e r e d.I t i s s p e c u l a t e d t h
17、a t L o A B I 1 g e n e m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e p r o c e s s o f b r e a k i n g b u l b s d o r m a n c y a t l o w t e m p e r a t u r e,a n d L o A B I 1 p r o t e i n m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n l i l y A B A s i g n a l t r a n s d u c t i o n.
18、K e y w o r d s:L i l i u m o r i e n t a l h y b r i d S o r b o n n e;A B I 1 g e n e;c l o n i n g;g e n e e x p r e s s i o n 休眠是一个复杂的生理过程,是对环境条件和季节性气候变化的生物学适应的结果,表现为含有分生组织的植物组织暂时停止生长1-2。已有报道认为,休眠是由内源激素中促进生长的激素与抑制生长的激素之间的平衡状态来决定的,抑制生长的激素(如脱落酸(A B A)的积累是引起休眠的原因,而休眠过程中促进生长的激素 生长素(I AA)、赤霉素(GA)和细胞分
19、裂素(C T K)的积累,是休眠解除的原因2。通常认为高水平的抑制物与鳞茎植物的休眠有关,其中以脱落酸为主,它存在于休眠组织和正在进入休眠的器官中,参与休眠的建立和维持,可能是引起休眠最重要的激素3。脱落酸在质体和细胞质中合成后,需要完成跨膜运输和信号转导,实现A B A信号由受体蛋白到转录因子最终到达靶基因的信号转导和应答4。拟南芥中,植物蛋白磷酸酶2 C(p r o t e i n p h o s p h a t a s e 2 C,P P 2 C)会抑制S n R K 2(s u c r o s e n o n-f e r m e n t i n g 1-r e l a t e d p
20、r o t e i n k i n a s e 2)激酶活性,导致A B A信号途径无法被启动;当植物体内脱落酸含量升高时,脱落酸会被受体蛋白P Y R/P Y L/R C A R(p y r a b a c-t i n r e s i s t a n c e/p y r a b a c t i n r e s i s t a n c e-l i k e/r e g u l a t o r y c o m p o n e n t o f a b s c i s i c a c i d r e c e p t o r s)感知和结合,同时形成与P P 2 C结合的界面,从而阻碍其与金属离子的结合
21、,最终导致P P 2 C的磷酸酶活性被抑制,S n R K 2被释放,进而激活了A B A信号途径下游基因的表达5。在高等植物中,P P 2 C蛋白磷酸酶通过A B A介导的信号途径参与调节多个生理过程6-1 0,包括种子的萌发与休眠,幼苗根系的伸长,保卫细胞及离子通道调控和气孔关闭,逆境胁迫的响应等1 1-1 2。目前,拟南芥中至少有8 0个P P 2 C 基因被挖掘和研究,其中主要 成员A B I 1(a b s c i s i c a c i d i n s e n s i t i v e 1)、A B I 2(a b s c i s i c a c i d i n s e n s i
22、t i v e 2)、HA B 1(h y-p e r s e n s i t i v e t o A B A 1)、AHG 3(A B A-h y p e r s e n s i-t i v e g e r m i n a t i o n 3)等,均为A B A信号途径的负调控因子1 3-1 6。东方百合品种花色丰富,浓郁芳香,具有很高的商业价值,其中 索邦 百合(L i l i u m O r i e n t a l H y-b r i d s S o r b o n n e)是最主要的切花品种之一1 7。百合鳞茎具有自然休眠的特性,休眠解除与否直接关系到种球质量和切花品质。未解除休眠的鳞
23、茎种植后会出现发芽率低和盲花等现象,低温处理是最常用的解除百合鳞茎休眠的方法3,但休眠解除机理仍不明晰。本研究以东方百合 索邦 为材料,克隆得到A B I 1基因,并进行生物信息学分析,在此基础上分析了A B I 1基因在鳞茎低温处理过程及种植后的表达模式,以期了解A B I 1的有关特性,从而为解析百合A B A 信号转导途径及其调控的低温解除休眠过程提供分子生物学基础。1 材料和方法1.1 试验材料以2 0 1 8年1 2月底在北京市怀柔基地种植的东方百合 索邦 为试验材料,分别取茎生根、上部叶、下部叶、嫩茎、花被片、花药、花丝、柱头、花柱、子房1 0种组织,用于荧光定量表达分析,每个样品
24、取至少3个生物学重复。以上所有材料经过液氮速冻后,立即放于-8 0 冰箱。根据前人的研究结果和课题组前期试验得到的百合种球解除休眠所需低温量为依据1 8-1 9,设置取材的时间节点和具体位置。设置常温对照组(2 3)和4 低温冷藏的实验组,于2 0 1 9年8月9日花谢采收前对茎尖进行第一次取材,然后将对照组和实验组分别置入2 3 温室和4 冷库中处理6 0 d,期间每隔7 d对茎尖取材1次,每次至少取3个生物学重复。于2 0 2 0年1 0月8日将对照组和实验组的百合种球定植于温室中(2 3),每隔1 4 d对百合茎尖取材1次,同时统计实验组和对照组植株1912期 赵一燃,等:东方百合L o
25、 A B I 1基因的克隆及表达分析的生长发育情况和成花情况。取材时按照百合种球鳞片的着生方式,将种球剥离至高度约1 c m,立即用解剖刀切下茎尖部分,并迅速速冻于液氮后,储存于-8 0 冰箱备用。取材部位见图1。1.2 试验方法1.2.1 总 R N A 的提取与 c D N A 的合成 将取材的组织在液氮条件下充分研磨,使用E A S Y S p i n P l u s植物R NA快速提取试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)提取样品总R NA,通过琼脂糖凝胶电泳检 测 合 格 后,保 存 于-8 0 冰 箱 中。使 用Q u a n t i t i e c t R e v e r s e
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