基于GBS-SNP的武夷茶..._L.)遗传分析及标记开发_李力.pdf
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1、茶叶科学 2023,43(3):310324 Journal of Tea Science www.tea- 收稿日期:2023-02-24 修订日期:2023-03-24 基金项目:福建省自然科学基金项目(2021J011135)、中央引导地方科技发展专项(2021L3058)作者简介:李力,男,讲师,主要从事茶树种质资源与遗传利用方面研究,。*通信作者: 基于 GBS-SNP 的武夷茶树(Camellia sinensis,Synonym:Thea bohea L.)遗传分析及标记开发 李力1,3,罗盛财2,王飞权1,3,黎巷汝1,4,冯花1,3,石玉涛1,3,叶江华1,3,刘菲1,赵佳林
2、1,李舒莹1,张渤1,3*1.武夷学院茶与食品学院,福建 南平 354300;2.武夷山市农业农村局,福建 南平 354300;3.武夷学院茶叶科学研究所,福建 南平 354300;4.福建农林大学园艺学院,福建 福州 350002 摘要:为深入了解武夷茶树(Camellia sinensis,异名:Thea bohea L.)的遗传多样性与背景关系,收集 126个武夷茶树品种/品系与 223 个来自 12 个不同地区的优异茶树品种/品系,共 349 份茶树资源。采用基因分型测序(Genotyping by sequencing,GBS)技术筛选出 973 个高质量核心 SNP 进行茶树遗传多
3、样性及背景关系分析。基于模型的遗传结构(Structure)、系统发育树(NJ tree)和主成分分析(PCA)结果表明,349 个茶树可分为 5 个亚群,亚群聚类主要是基于茶树之间的亲缘关系,而不是树型或叶形等形态特征。基因流分析表明,从闽南地区到武夷山地区和武夷山地区到浙江地区存在基因渗入。遗传相似度分析显示,在 349 个茶树中有 136 对样本的遗传相似系数大于 0.9,其中有 26 对涉及武夷茶树品种/品系。通过两两比对的辨识度分析,从 973个 SNP标记中筛选出 21个可 100%识别 349个茶树品种/品系的 SNP标记,其中 18个 SNP标记即可 100%识别 126 个武
4、夷茶树品种/品系,并建立遗传指纹图谱与开发鉴定引物。研究结果为今后武夷茶树种质资源的管理和育种提供有价值的信息。关键词:武夷茶;基因分型测序;遗传相似度;基因流;指纹图谱;鉴定引物 中图分类号:S571.1,S326 文献标识码:A 文章编号:1000-369X(2023)03-310-15 Genetic Analysis and Marker Development for Wuyi Tea(Camellia sinensis,Synonym:Thea bohea L.)Based on GBS-SNP LI Li1,3,LUO Shengcai2,WANG Feiquan1,3,LI X
5、iangru1,4,FENG Hua1,3,SHI Yutao1,3,YE Jianghua1,3,LIU Fei1,ZHAO Jialin1,LI Shuying1,ZHANG Bo1,3*1.Wuyi University College of Tea and Food,Nanping 354300,China;2.Agricultural and Rural Bureau in Wuyishan,Nanping 354300,China;3.Tea Science Research Institute of Wuyi University,Nanping 354300,China;4.F
6、ujian Agriculture and Forestry University,College of Horticulture,Fuzhou 350002,China Abstract:In order to understand the genetic diversity background of Wuyi tea(Camellia sinensis,Synonym:Thea bohea L.),126 Wuyi tea cultivars/strains and 223 elite tea cultivars/strains(a total of 349 tea germplasm
7、resources)from 12 different regions were collected.Genotyping by sequencing(GBS)technology was used to screen 973 DOI:10.13305/ki.jts.2023.03.0013 期 李力,等:基于 GBS-SNP 的武夷茶树(Camellia sinensis,Synonym:Thea bohea L.)遗传分析 311 high-quality core SNPs for genetic diversity and background analysis.Model-based
8、 structure(Structure),phylogenetic tree construction(NJ-tree)and principal component analysis(PCA)show that the 349 tea resources could be divided into 5 subgroups,and the clustering of subgroups was mainly based on the genetic relationship between tea resources,rather than morphological characteris
9、tics such as tree type or leaf shape.Gene flow analysis shows that Wuyi tea might have spread from southern Fujian Province to Wuyi Mountain in northern Fujian Province and from Wuyi Mountain to Zhejiang Province.Genetic similarity analysis shows that among 349 tea cultivars/strains,136 pairs of cul
10、tivars/strains had genetic similarity greater than 0.9,among which 26 pairs involved Wuyi tea.Based on the results of gene flow and genetic similarity,the genetic relationship and background of some representative and controversial Wuyi tea were discussed and analyzed.Furthermore,through the discern
11、ibility analysis of pairwise comparison,21 SNPs were selected from 973 SNP markers that can 100%identify 349 tea cultivars/strains,among which 18 SNPs could 100%identify 126 Wuyi tea cultivars/strains.Genetic fingerprints were established and identification primers were developed.These results provi
12、ded valuable information for the management and breeding of Wuyi tea in the future.Keywords:Wuyi tea,GBS,genetic similarity,gene flow,genetic fingerprints,identification primer 武 夷 茶 是 山 茶 科(Theaceae)山 茶 属(Camellia)的一类成员,以“武夷”的英文音译而被命名为 Bohea 或 Var Bohea(Thea Bohea Linnaeus.1762)。武夷茶生长于中国福建省北部的武夷山,武
13、夷山被认为是乌龙茶和红茶的发源地1-2。武夷山地区的先民从有性系的武夷茶树群体中筛选分离出品质优良的稀有单丛单株,通过无性繁殖传承至今,成为现在著名的“武夷名丛”3。由于武夷茶树生长在岩石土壤中,其鲜叶制作的茶叶具有“岩韵”(风味浓郁,香味持久)的品质特点,被称为武夷岩茶,是中国十大名茶之一,具有巨大的经济和文化价值4。历史上记载的武夷茶树品种有上千种。然而,许多种质资源不断消失,通过对茶树性状的长期观察,目前仅收集到百余个种质资源5-6。此外,武夷山当地的育种过程中存在对优良品种过度选择的情况,将导致群体遗传多样性越渐狭窄,最终影响品种性状的综合改良,再加上存在茶树同物异名的现象,进一步阻碍
14、了武夷茶树种质资源的开发。因此,对武夷茶的遗传背景分析和品种鉴定是一项重要的工作。传统的茶树种质资源分类基于形态或农艺性状,容易受到环境条件的限制7,这给品种的确定带来了一定的困难8。国际植物新品种保护联盟(UPOV)对作物品种建立了“差异性、统一性和稳定性”测试制度9,在难以通过表型区分确认新品种的情况下,DNA 指纹图谱可以帮助提高品种的识别。新修改的中华人民共和国种子法 于 2022 年 3 月 1 日正式施行,首次建立实质性派生品种(Essentially derived variety,EDV)制度10,要求对品种的基因或基因型组合进行特异性检测鉴定。建立真实可靠的 DNA 鉴定检测
15、技术对新种子法修订条例的实施具有重大战略意义。目前,茶树的特异性 DNA 鉴定手段仍相对落后于主要农作物,早期的茶树特异性DNA 鉴定方法多采用第一代或第二代分子标记,包括扩增片段长度多态性(AFLPs)、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性 DNA(RAPD)、简单序列重复序列(SSRs)等11-14,武夷茶树也是如此15-17。虽然这些传统方法各有优势,但所使用的标记数据量有限,不适合大样本量的群体分析,不能充分反映物种的遗传多样性。相比之下,第三代分子标记技术单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)18-20具有一定的优势,已逐步
16、成为主流的分子标记21。Lin 等22采用高通量 SNP 技术构建了 4 个主要乌龙茶产区的 DNA 指纹图谱,揭示了 4 个产区的遗传关312 茶 叶 科 学 43 卷 系。Liu 等23从茶树的表达序列标签(EST)数据库中筛选出 49 个 SNP 位点,分析了武夷山及其邻近地区 137 份茶树种质的遗传多样性丰富程度及遗传关系。这表明高通量 SNP技术在寻找和验证茶树亲本关系方面具有很大的发展空间。然而,茶树的 SNP 分子标记开发发展较晚,数量有限,仍需不断完善补充。传统的 SNP 筛选方法需要大量的人力资源和较长的时间,基因分型(Genotyping by sequencing,GB
17、S)测序技术可以快速识别高密度 SNP 位点,广泛应用于作物种质鉴定、群体结构分析和全基因组关联分析24-25。本研究收集了 126 份武夷茶品种/品系,结合来自12 个省份的 223 份优异茶树种质资源,共 349份茶树样本进行 GBS 测序,利用高质量 SNPs对武夷茶进行遗传多样性及背景分析,并开发一种简便、快速的茶叶 SNP 分子标记鉴定,旨在为茶树研究领域 EDV 制度的有效实施提供参考。1 材料与方法材料与方法 1.1 样本收集与 DNA 提取 样品来自武夷山市龟岩茶树种质资源保护基地(福建省优异茶树种质资源保护区闽茶圃 004,N 274342.46,E 118014.40)和武
18、夷学院茶树种质资源圃(N 276101.34,E 1179663.51),包括 126 个武夷茶品种/品系及 223 个来自 12 个省份的茶树品种/品系,共349 个(包含同一品种/品系的 6 对)。样本信息见附表 1(扫文后二维码查看附表 1)。新鲜叶片基因组 DNA 采用植物基因组DNA 提取试剂盒(康威 CW0553S)提取,DNA浓度和纯度采用 NanoDrop 紫外分光亮度计(Thermo Scientific,USA)测定。DNA 完整性使用 0.8%琼脂糖电泳检测,基因组 DNA 保存于80。1.2 基因分型测序及建库 GBS 库的构建参照文献26,用限制性内切酶(EcoR 和
19、 Nia)酶解质检合格的基因组 DNA,在酶切后的片段两端加上相应的适配接头,利用 PCR 扩增两个接头之间的片段,共构建了 349 个对应样本的多重库,每个库 DNA 样本都有唯一的适配接头。将样品混合后进行电泳回收纯化,纯化产物质检合格后使用 Illumina NovaSeq 6000 测序平台(上海凌恩生物科技有限公司)进行双末端测序。测序获得的原始序列数据(Raw read)去除低质量序列,有效的高质量序列(Clean read)数据经 BWA v0.7.10 软件27比对茶树基因组28,利用 SAMTOOLS v1.9 软件将 sam 转换为 bam 文件。GATK v4.1.2.0
20、 软件用于检测SNP,初始 SNP 质量过滤标准为“QD2.0|MQ 40.0|FS 60.0|SOR 3.0|MQRankSum 12.5|ReadPosRankSum 8.0”。使用 VCF v0.1.11 软件对 SNP 进行严格过滤29,经过测序深度 4X,缺失率(Miss rate)10%、次等位基因频率(MAF)0.05,多态信息含量(PIC)0.15,SNP 位点两侧150 bp 无变异的过滤,最终共获得 12 937 679个 SNP。从 12 937 679 个 SNP 中筛选出遗传多样性较高且均匀分布在 15 个染色体上的核心 SNP(去除重组率为 0 的冗余位点、MAF0
21、.15、Miss rate5%、PIC0.15)用于后续分析。使用 PowerMaker v3.25 软件30计算观察到的杂合度(Observed heterozygosity,Ho)值和基因多样性(Gene diversity,GD)值。1.3 茶树群体遗传多样性及结构分析 使用 Admixture 软件分析种群结构31。根据隶属度系数(Q)的取值对所有品种进行划分,根据交叉验证误差(CV 误差)确定最优K 值。主成分分析(PCA)使用 Plink 软件进行,使用 R v3.4 进行可视化绘图32。利用MEGA软 件 的 邻 接 法(Neighbor-joining method,NJ)构建
22、系统发育树,软件分析均采用默认参数设置,使用 iTOL 在线软件编辑系统发育树33。3 期 李力,等:基于 GBS-SNP 的武夷茶树(Camellia sinensis,Synonym:Thea bohea L.)遗传分析 313 1.4 基因流分析 根据茶树文献资料34-35按茶树原产地(以省/直辖市为单位)对 349 个茶树进行分组,为探索武夷山地区茶树的历史遗传基因流,进一步将福建省的地区划分为福建武夷山区(FJW)、闽东区(FJE)、闽南区(FJS)和福建未知区(FJU)。为减少误差,少于 5 个品种的地区组被排除分析。最后,共采用 11地区组进行分析(附表 1)。使用 TreeMi
23、x v1.01软件进行基因流分析36,分别设定假设有111 次基因流事件(m=111),以箭头表示不同组之间的基因渗入。1.5 遗传相似度分析 使用软件 NTSYSpc v2.1137进行遗传相似度分析,计算 SNP 的分布频率和遗传相似系 数(Genetic similarity,GS),GS=NS/(NS+ND)。式中,NS 为相同 SNP 基因型数量,ND 为不同 SNP 基因型数量38。缺失的基因型被视为无效基因型。根据国际种子联合会39的建议,GS 值大于 0.9 可作为实质派生关系的有力证据。因此,GS0.9 的品种对被认为是近似品种,具有派生关系。349 个茶树中有 6 对来自不
24、同生长地的同一品种/品系,作为明确为实质派生关系的阳性对照,将其中最小的 GS 值作为具有无可争议的派生关系的阈值。当茶树样本的 GS 值大于该阈值,将这对样本明确为具有派生关系。1.6 简易鉴定 SNP 开发 在 973 个核心 SNP 的基础上,使用 Perl方法以 349 个样本成对比较的可辨性为过滤条件,选择一组数量最少且可辨性高的 SNP标记用于品种简单快速鉴定40-41。在 SNP 侧翼两个保守区域设计引物,随机进行一代测序验证。2 结果与分析结果与分析 2.1 全基因组 SNP 筛选 349 份茶树种质资源共获得 829.05 G 高质量测序数据,平均每个样品获得2.38 G数据
25、,Q20(碱基错误率在 1%以下)平均占比 98%,Q30(碱基错误率在0.1%以下)平均占比93.05%,平均获得高质量序列条数 5 737 108 966,平均有 5 668 097 099 条序列可以匹配到茶树参考基因组,平均覆盖率为 98.83%,表明测序质量较高。经过严格过滤筛选(Miss rate20%、MAF10%),共获得 12 937 679 个 SNP。测序获得的原始数据上传 NCBI 数据库(项目号:PRJNA924950)。以去除重组率为 0 的冗余位点、MAF0.15、Miss rate5%、PIC0.15 且较均匀分布在茶树基因组 15 条染色体上为筛选条件,共获得
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