基于HPLC-Q-Exac...药效物质基础和作用机制研究_徐才猛.pdf
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1、Journal of Inner Mongolia Medical UniversityApr.2023Vol.45No.2基于 HPLC-Q-Exactive MS/MS和分子对接技术的通拉嘎-5抗绝经后骨质疏松药效物质基础和作用机制研究(内蒙古医科大学 药学院,内蒙古 呼和浩特010059)【摘要】目的 阐释通拉嘎-5抗绝经后骨质疏松的药效物质基础和作用机制。方法 采用HPLC-Q-ExactiveMS/MS技术分析通拉嘎-5的入血原型成分,并利用分子对接技术表征入血原型成分与雌激素受体ER的结合能,探讨通拉嘎-5抗绝经后骨质疏松的作用机制。结果 分析得到入血原型成分26个,主要包括生物碱
2、类、酚酸类和挥发油类;其中,桂二萜醇、荜茇环碱、胡椒碱、二氢胡椒碱和1,3-Benzodioxle-5-propanal与ER、ER结合能均-5 kcal mol-1,鞣花酸、对羟基苯甲酸、二氢荜茇明宁碱、荜茇宁、胡椒油碱B、(2E,4E,12Z)-N-Isobutylocatadeca-2,4,12-trienamide与Er结合能-5 kcal mol-1。结论 通拉嘎-5中桂二萜醇、胡椒碱等11个入血原型成分可能作用于雌激素受体发挥抗绝经后骨质疏松的作用,可为该方质量控制研究和临床合理应用提供参考。【关键词】通拉嘎-5;入血成分;HPLC-Q-Exactive MS/MS;绝经后骨质疏松
3、症中图分类号:R285文献标识码:B文章编号:2095-512X(2023)02-0140-05徐才猛,董 馨,胡少男,王 智,王 坤,任 艾,薛培凤*收稿日期:2022-12-08;修回日期:2023-03-15基金项目:国家自然科学基金项目(82160745);内蒙古医科大学致远人才计划项目(ZY0120014);内蒙古医科大学大学生创新创业训练计划项目(202210132056)第一作者:徐才猛(1995),男,2020级在读硕士研究生。E-mail:*通信作者:薛培凤,女,理学博士,教授,硕士研究生导师。研究方向:中蒙药药效物质基础及质量控制。E-mail:通拉嘎-5(tonglaga
4、-5,TLG-5)又名五味清浊散、当玛-5等,由石榴、红花、豆蔻、肉桂、荜茇五味药组成,始载于 四部医典,为蒙古族验方1。中华人民共和国药典 2020年版记载其具有开郁消食、暧胃的功效,用于治疗食欲不振、消化不良、胃脘冷痛、满闷嗳气、腹胀泄泻2。现代研究表明,通拉嘎-5还具有抗骨质疏松的功效,可以促进骨形成,改善骨代谢3,4,但其抗骨质疏松的物质基础和作用机制尚不明确。目前通拉嘎-5的研究大部分集中在药效和质量控制研究,对其化学组成和药效机制研究甚少。绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporo-sis,PMOP)是雌激素缺乏导致的一种中老年女性常见疾病,65岁以上人群患
5、病率高达32.0%5。雌激素可通过雌激素受体(estrgen receptor,ER)调控靶基因转录翻译而发挥生理作用6。该受体是一种甾体类激素超家族的核受体,包括(ER)和(ER)两种亚型7,且二者在骨组织中均有表达。其中,ER在维持骨密度、调节女性生殖代谢等方面起重要作用8,而ER的多态性也与高骨密度相关9。研究表明,雌激素可激活成骨细胞的ER及其下游相关信号转导途径,以促进成骨细胞增殖分化10;其还可通过直接作用和间接作用抑制破骨细胞功能,并促进破骨细胞凋亡11。此外,通拉嘎-5君药石榴中的主要成分鞣花酸可上调ER受体mRNA表达,增加雌激素活性,诱导成骨细胞结节矿化12,13,且石榴籽
6、油具有雌激素样作用14;臣药红花中大量的木脂素和类黄酮可发挥雌激素样作用,通过与ER结合激活MAP激酶,以刺激成骨细胞增殖分化15。因此,我们考虑通拉嘎-5抗骨质疏松作用可能与激活ER有关。高分辨质谱技术广泛应用于固有化学成分分析、血清药物化学研究等16,17。本课题组前期利用该技术分析了TLG-5的固有成分,发现其主要包括酚酸类、黄酮类、生物碱类和挥发油类成分,但其入血原型成分尚不明确。因此,本研究采用HPLC-Q-Exactive MS/MS 技 术,结 合 Xcalibur 和 CompoundDiscoverer 3.0 工作平台对TLG-5入血原型成分进行分析。在此基础上,利用分子对
7、接技术对与雌激素受体(ER、ER)具有良好结合活性的原型成分进行筛选,为阐明TLG-5药效物质基础和作用机制 140DOI:10.16343/ki.issn.2095-512x.2023.02.010内蒙古医科大学学报2023 年 4 月第 45 卷第 2 期提供科学依据,也为质量控制和临床合理应用提供参考。1实验材料1.1药品与试剂石榴(批号:190801)、豆蔻(批号:191112)、肉桂(批号:221001)、红花(批号:E2112190301)、荜茇(批号:20101108),以上药材均经内蒙古医科大学薛培凤教授鉴定,分别为石榴科植物石榴(Punicagranatum L.)的干燥果皮
8、和种子;菊科植物红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花;姜科植物白豆蔻(Amomum kravanh Pierre ex Gagnep.)或爪哇白豆蔻(Amomum compactum Soland ex Maton)的干燥成熟果实;樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥树皮;胡椒科植物荜茇(Piperlongum L.)的干燥近成熟或成熟果穗。色谱甲醇、色谱乙腈均购自Thermo-Fisher 公司,色谱甲酸购自罗恩试剂,纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司。1.2实验仪器Q-Exactive 液相色谱-质谱联用系统(美国,Thermo-Fi
9、sher 公司);高效液相色谱仪ThermoUlti-Mate3000 系统(美国,Thermo-Fisher 公司);Com-pound Discover 3.0 软件(美国,Thermo-Fisher 公司);METTLER TOLEDO AB135-S 电子分析天平梅特勒托利多科技(中国)有限公司。1.3实验动物SPF级SD大鼠,雄性,体质量160200 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2021-0011。大鼠饲养于内蒙古医科大学实验动物中心,实验前适应性喂养1周,以标准SPF 级鼠饲料喂养并自由饮用纯净水,并在实验开始前12 h 禁食不禁水。所有动物实
10、验经内蒙古医科大学实验动物伦理委员会批准。2实验方法2.1灌胃药液制备取石榴、红花、肉桂、豆蔻和荜茇五味药材粉碎,过40目筛,按照8 4 1 1 1比例混匀。称取该混合粉末200 g,加入10倍量蒸馏水,超声提取3次,每次 1 h;合并提取液,减压浓缩,冷冻干燥制成TLG-5冻干粉,并加蒸馏水配制成质量浓度为0.5g/mL的TLG-5溶液。2.2实验分组与处理将12只SD大鼠按随机数表法分为空白组和给药组,给药组以0.05 g/kg剂量灌胃TLG-5溶液,空白组灌胃等量蒸馏水。每隔2 h灌胃1次,连续灌胃3 次,最后 1 次给药h 后,腹主动脉取血,静置,3500 r/min离心10 min,
11、取上清液,-80 保存,备用。2.3血清样品处理取1 mL血清置EP 管中,加4 mL甲醇-乙腈混合溶液(V V=1 1),涡旋 10 min,4 条件下13500 r/min离心 10 min,取上清;将上清置真空离心浓缩仪中浓缩干燥,并将残余物溶解于100 L色谱甲醇中,涡旋10 min,4 条件下12000 r/min离心10 min,取上清液,备用。2.4色谱条件色谱柱:Thermo ODS-2 HYPERSIL C18色谱柱(250 mm4.6 mm,5 m);流动相:有机相(A)为乙腈,水相(B)为0.1%甲酸水溶液。梯度洗脱程序为:0.040.0 min,7%100%(A);40
12、.050.0 min,100%(A);50.150.1 min,100%7%(A);50.160 min,7%(A);流速为1 mL/min,进样量10 L;柱温35。2.5质谱条件采用电喷雾离子源(ESI),Full-MS ddms2模式,正、负离子两种模式下获取质谱信息。负离子质谱条件为:(1)鞘气流速:35L/min;(2)辅助气流速:10L/min;(3)喷雾电压:2.8 kV;(4)毛细管离子传输管温度:350;(5)S-lens电压:50 kV;(6)加热温度:150,质谱扫描范围为1101000 m/z。正离子质谱条件的喷雾电压为3.5 kV,其余条件同负离子模式。2.6入血原型
13、成分分析对各样本进行HPLC-Q-Exactive MS/MS分析,利用Xcalibur平台得到相关数据图谱,将分析所得数据信息导入Compound Discoverer 3.0软件进行峰提取和峰匹配,根据保留时间、精确相对分子量和二级质谱裂解碎片,鉴定和推测入血原型成分。2.7分子对接利用 TCMSP 数据库(https:/tcmsp- 数据库(https:/pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获 取 化 合 物 mol2 格 式 文 件,并 在 PDB 数 据 库(https:/www.rcsb.org/)下 载 ER(PDBID:7ujw)和ER(PDBID:7xvz)p
14、db格式的蛋白结构;通过Dis-covery Studio Visualizer 4.5软件进行去水、去残基等处理,并利用Autodock软件进行加氢、加电荷和设置对接口袋等,以结合能-5 kcal mol-1为标准筛选TLG-5发挥雌激素样作用的有效成分。141Journal of Inner Mongolia Medical UniversityApr.2023Vol.45No.23结果3.1入血原型成分分析在正负离子扫描下,共鉴定出酚酸类成分 5个,包括原儿茶酸、香草酸、鞣花酸、3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙酸和4-羟基苯甲酸;黄酮类成分1 个,为羟基红花黄色素A;生物碱类成分8个,
15、包括葫芦巴碱、二氢荜茇明宁碱、荜茇宁、胡椒新碱、胡椒碱、荜茇环碱、胡椒油碱 B、(2E,4E,12Z)-N-Isobutylo-catadeca-2,4,12-trienamide;有机酸类成分3个,包括柠檬酸、琥珀酸、苯甲酸;挥发油类成分8个,包括桂二萜醇、肉桂酸、榄香素、-亚麻酸、亚油酸、油酸、硬脂酸和花生四烯酸;其他1个,1,3-Benzodioxole-5-propanal;共计26个入血原型成分。鉴定结果见表1。序号1234567891011121314151617181920212223242526tR/min2.953.493.545.065.677.908.509.0610.4
16、010.5711.0513.7313.8614.4320.0120.3021.3221.8627.5528.5832.4734.6936.6737.3440.7345.31分子式C6H8O7C7H7NO2C4H6O4C7H6O4C27H32O16C7H6O2C20H32O7C8H8O4C14H6O8C9H8O2C7H6O3C12H16O5C12H16O3C10H10O3C16H21NO3C16H19NO3C17H21NO3C17H19NO3C21H27NO3C21H29NO3C18H30O2C18H32O2C22H39NOC18H34O2C18H36O2C20H40O2相对分子质量理论值191
17、.01973138.05496117.01933153.01933611.16176121.02950383.20753167.03498300.99899147.04515137.02442239.09250209.11722177.05572276.15942274.14377288.15942286.14377342.20637344.22202277.21730279.23295334.31044281.24860283.26425311.29555实测值191.01874138.05600117.01796153.0182611.16321121.02815383.20758167.
18、03377300.99899147.04414137.02322239.09201209.11827177.05460276.16129274.14517288.16153286.14563342.20782344.22244277.21729279.23303334.31247281.24878283.26440311.29596误差-5.187.53-11.71-7.382.37-11.150.13-7.240.00-6.87-8.76-2.055.02-6.336.775.117.326.504.241.22-0.040.296.070.640.531.32离子M-H-M-H+M-H-M
19、-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H-M-H+M-H-M-H-M-H-M-H-M-H+M-H+M-H+M-H-M-H-M-H+M-H-M-H-M-H-碎片离子(m/z)191.01874,147.02895,129.01836,111.00743,87.00733138.05600117.01796,99.00748,87.04368,73.02804153.0182,135.00751,109.02818,87.00736611.16321,491.11951,473.11014,403.10468,325.07175,283.00311,119.048831
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