蓝细菌螺旋拟柱孢藻的抑菌活性研究_聂利华.pdf
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1、蓝细菌螺旋拟柱孢藻的抑菌活性研究聂利华,张宇超,钟富胜,肖 璐,郑雅琼(揭阳职业技术学院生物工程系,广东揭阳)摘要 目的探讨螺旋拟柱孢藻藻株是否具有潜在的抑菌活性。方法从汕头澄海人工对虾养殖池分离纯化藻株,通气扩大培养、离心收集、冷冻干燥后,采用乙醇提取并用柱层析分离,先后得到藻体的乙醇提取物和叶绿素提取物。以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为受试菌种,采用圆形纸片法进行抑菌活性研究。结果藻体乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑菌作用,其抑菌直径分别为、;藻叶绿素粗提物仅对金黄色葡萄球菌有抑菌作用,抑菌直径为 。结论螺旋拟柱孢藻乙醇提取物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有中等强度的抑菌活性,而藻体叶绿
2、素提取物仅对金黄色葡萄球菌抑菌,但呈高灵敏抑菌效应,该藻株有望成为生物抑菌来源物质的新型材料而得到进一步开发利用。关键词 蓝细菌;螺旋拟柱孢藻;乙醇提取物;叶绿素提取物;抑菌活性中图分类号 文献标识码 文章编号():开放科学(资源服务)标识码():,(,),;,;基金项目 揭阳职业技术学院创新强校工程()立项项目();揭阳市科技计划项目();揭阳职 业 技 术 学 院 校 级 大 学 生 创 新 创 业 训 练 项 目();广 东 省 科 技 创 新 战 略 专 项 资 金()。作者简介 聂利华(),女,湖北仙桃人,讲师,硕士,从事水生微生物生理与药理活性研究。收稿日期 寻找能够抗植物病原体、
3、水生动物病原体、人类病原体的有效化合物一直是科学家们研究的热点之一,特别是近年来随着抗生素类药物的滥用、环境污染的加剧,人类免疫力逐渐下降造成新的致病菌、条件致病菌及超级耐药菌日益增多等全世界面临的严峻的社会问题,寻求安全有效的抗菌来源物质显得尤为迫切,天然中草药植物及微生物资源在抗菌活性物质的来源方面承担着重要的角色。拟柱孢藻是一种具有原核微生物特性与植物双重特性的水生蓝细菌藻类物质,属于蓝藻纲念珠藻目念珠藻科拟柱孢藻属,以拉氏拟柱孢藻()为模式种,其生存适应力高、入侵性强,是近年来呈全球性扩张分布的一种新型淡水蓝藻,它首次入侵某一水体几年后就能形成强烈占优势的水华藻。查广才等在凡纳滨对虾健
4、康养殖与虾池环境微生物生态研究中,发现一株在虾池中呈优势生长且其生长与水体致病性弧菌及其他藻类等水生生物数量呈负相关的拟柱孢藻,后经形态与基因鉴定等方面证实,此藻为一株少见的呈螺旋形不产毒的拟柱孢藻,暂命名为螺旋拟柱孢藻()。为探究此藻株潜在的抑菌性能,该试验在前期采样、分离、鉴定的基础上,扩大培养并收集、采用乙醇提取获得醇提物,另外用柱层析分离藻体的叶绿素粗提物,以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为供试细菌,用圆形纸片法进行抑菌试验,为天然抑菌活性物质来源提供参考。材料与方法 试验材料 试验蓝细菌藻株采于汕头澄海人工凡纳滨对虾养殖池,所用菌种金黄色葡萄球菌和大肠杆菌来自揭阳职业技术学院微生物实验室
5、。受试细菌选用营养琼脂培养基(购自广东凯微生物科技有限公司)进行培养。试验蓝细菌藻株的基础培养基采用该实验室前期摸索出来的改良 培养基进行,其含量配方如下:、(的成分主要有 、(),双纯水定容至 ,用 的氢氧化钠与 的盐酸调 为。试验仪器 明美拍照显微镜(明美科技有限公司);超声波细胞粉碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);台式冷冻离心机(上海户湘仪离心机仪器有限公司);真空冷冻干燥机(北京松源华兴安徽农业科学,():科技发展有限公司);霉菌培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司);智能光照培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂);立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。试验方法 藻株培养与
6、离心收集。在前期摸索出最佳培养基的基础上,进行无菌通气扩大培养,通气速率为 ,培养 条 件 为 温 度()、光 照 、光 暗 周 期 。每天观察生长及藻色变化,并定期检查通气装置,待其对数生长期时进行离心收集(,),之后进行冷冻干燥获得藻体。藻乙醇提取物的制备。称取 干藻,加入 乙醇,采用研磨、浸渍、超声波(、功率 、超声、静置 )提取,完成置于 离心管中后拧紧离心管盖子,常温放置 ,离心、取上清液即可得到藻类乙醇提取液。藻体叶绿素的提取与分离。称取 干藻,加入 乙醇 ,采用研磨、浸渍、超声波(、功率 、超声、静置 )提取多次,合并滤液,并用旋转蒸发仪蒸发得到浸膏,加入少量 乙醇溶解,得到浓的
7、粗产品,之后采用氧化铝柱层析分离纯化,湿法装柱、上样、用 乙醇进行洗脱,收集流出液,即得到纯化的色素。菌悬液的制备。采取涂布和划线的方法将金黄色葡萄球菌与大肠杆菌进行纯化培养,之后挑选单菌落接种于装有 营养肉汤培养基的 锥形瓶中,置于霉菌培养箱中,培养 。采用 麦氏比浊法,用无菌生理盐水将菌培养液配制成 ,稀释至 后,即制成试验所用的菌悬液,保存备用。抑菌活性测定。采用圆形纸片法进行抑菌试验设计,除提取物试验组外,试验设置对照组有无菌蒸馏水空白对照、氨苄青霉素钠阳性对照、细菌纯菌培养对照和溶剂阴性对照,其中各提取物试验组、氨苄青霉素钠阳性对照和溶剂阴性对照制作相应的药敏纸片。试验时,加 菌悬液
8、于平板上,均匀涂布,摆放在直径为 已制作好的药敏纸片上,在 培养 后观察结果,测量抑菌圈。每个样品设 个平行,结果取平均值。结果与分析 分离藻株生长情况 分离纯化的藻体镜下观察呈卷曲、螺旋的丝状,末端尖细,宽度 ,长度可至 、多数 (图),偶见异形孢,顶生。图 分离藻株的镜下观察()()抑菌活性 图 和表 是螺旋拟柱孢藻乙醇提取物采用圆形纸片法对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌结果。图 的 是无菌蒸馏水空白对照,表明操作无污染;是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的单纯菌接种,说明这 种细菌在营养琼脂培养基生长良好,并且培养和操作过程中没有被污染;是溶剂挥发至干的药敏纸片(乙醇的挥发干片)对 种受试菌的抑
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