孔雀球虫的分子鉴定及其ITS_rRNA基因序列分析_张誉方.pdf
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1、动物医学进展,():孔雀球虫的分子鉴定及其 基因序列分析收稿日期:基金项 目:云 南 省 朱 兴 全 专 家 工 作 站 项 目();云 南 农 业 大 学 兽 医 公 共 卫 生 省 创 新 团 队 项 目()作者简介:张誉方(),女,山东烟台人,硕士研究生,主要从事人畜共患兽医寄生虫病研究。刘永张(),男(土家族),云南大姚人,兽医师,本科,主要从事野生动物的疾病防治工作。同等贡献作者。通讯作者张誉方,刘永张,贺君君,邹丰才,杨建发(云南农业大学动物医学院,云南昆明 ;云南省昆明动物园,云南昆明 )摘要:为了解云南省昆明市孔雀感染球虫的种类及种属关系,采集昆明市个动物园孔雀粪便样品及肠道内
2、容物样本进行球虫卵囊的收集,进行形态学鉴定,扩增球虫 基因,测序和序列分析,并利用 软件构建遗传系统进化树。结果显示,扩增的 基因序列长度为 和 ,共鉴定出种球虫,分别为和缓艾美耳球虫()和火鸡和缓艾美耳球虫(.),相似度均为 ;进化分析结果表明,孔雀和火鸡之间可能存在球虫的交叉感染风险。该研究结果丰富了野生雉类寄生虫病的资料。关键词:孔雀;球虫;基因;基因序列分析中图分类号:;文献标识码:文章编号:()云南省作为生物多样性宝库和西南生态安全屏障,依靠其独特的地理位置与气候特点,成为了动植物生存繁衍的自然天堂。孔雀作为云南的名片,同时也是云南的“形象代言人”。在孔雀的种群中,绿孔雀被列为世界自
3、然保护联盟濒危物种,是我国国家级重点保护野生动物,也是中国传统文化中具有重要代表意义的物种;而蓝孔雀作为特种经济动物,其和白孔雀的观赏价值居于前列,相比于绿孔雀,它们具有良好的食用价值和药用价值。球虫对许多宿主有严重危害,能引起家畜、家禽、野生动物甚至人体的球虫病,可导致宿主生产性能降低,幼体因感染球虫而大量死亡,从而造成极大的经济损失。孔雀作为球虫的易感宿主,其球虫病是由艾美耳属或等孢属球虫感染所引起的一种原虫病。由于不科学的饲养管理,饲养场所被球虫卵囊污染,使孔雀患上球虫病,致使其生长受阻、贫血;幼龄孔雀感染球虫多因抵抗力低下而造成死亡,从而威胁孔雀的种群数量和种群健康。本研究对来自昆明市
4、个动物园的孔雀粪样及其肠道内容物分离获得的球虫卵囊进行形态学观察、基因组 的提取和基于内转录间隔区(,)基因序列的聚合酶链反应(,)进行扩增,分析其基因序列并鉴定其种属。以期能够拓展目前对孔雀球虫种类的认识,有利于园区对患球虫病孔雀针对性用药并制定科学合理的防治方案,促进濒危动物和生物多样性保护。材料与方法材料样品来源孔雀粪样及肠道内容物采自昆明市个动物园,用自封袋分装,逐一对应编号登记,置于低温保存。主要试剂无水乙醇、琼脂糖粉、双蒸水、缓冲液、缓冲液、粪便 提取试剂盒,天根生物科技(北京)有限公司产品;核酸染料(全 式 金),丰 科 生 物 科 技 有 限 公 司 产 品;、()、酶、标准
5、、,宝生物工程(大连)有限公司产品。主要仪器设备 仪(),公司产品;凝胶成像系统(),大韩科学仪器有限公司产品;高速台式离心机(),公 司 产 品;电 子 分 析 天 平(型),德国赛多利斯公司产品;旋涡混合器(),江苏海门市麒麟医用仪器厂产品;恒温水浴箱(),深华生物技术有限公司产品;瞬时迷你离心机(),湘仪离心机仪器有DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.06.018限公司产品。方法样品预处理对孔雀粪样及肠道内容物进行预处理,包括球虫的分离和纯化,具体操作参考陈培培等的方法。形态学观察将收集到的孔雀球虫卵囊液用磷酸缓冲盐溶液(,)清洗次,用移液器吸取少量卵囊液至载玻
6、片,放置于光学显微镜下镜检。将观察到的球虫卵囊进行测量并拍照。球虫卵囊的形态学特征为卵囊呈球形或亚球形,囊壁分内外层,可能有卵膜孔,孢子化卵囊内有个孢子囊,每个孢子囊内含有个子孢子。卵囊和孢子囊内分别由卵囊残体和孢子囊残体。基因组 提取及 扩增取少量卵囊液,用双蒸水反复冲洗次后,分别置于离心管中,编号为,参考基因组 提取试剂盒说明书提取球虫基因组,样品置 于 冰箱保存备用。参考李清月等扩增艾美耳球虫属 基因的引物,扩增球虫的 基因,上游 引 物:()和 下 游 引 物:(),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应扩增体系在 下进行,包括 (),(),(),上、下游引物()各,聚合酶,
7、模板 和灭菌双蒸水。扩增程序为:预变性 ;,共 个循环;最后 延伸 ,结束反应,同时设阴 性 对 照。取 产 物 进 行 琼脂糖凝胶电泳,用 核酸染料染色,紫外投射仪下观察结果,凝胶成像系统摄像。基因部分序列测定及系统进化树构建将阳性 产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序,测序结果进行拼接,并于 进行 在线比对分析。利用 软件构建进化树(),以兔隐孢子虫()作为外群,方法为邻接法(),置信值重复抽样 次。结果形态学观察未孢子化的孔雀球虫卵囊呈 卵 圆 形,大小为 ,卵壁光滑,有卵囊残体,无极帽。孢子化卵囊呈卵圆形,大小为 ,孢子囊呈椭圆形,大小为 ,有孢子囊残体(图)。球虫未孢
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