雷帕霉素对脱氢表雄酮诱导P...巢组织的影响及作用机制探讨_陈文莉.pdf
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1、20232023 年3 月第 54 卷第 3 期年3 月第 54 卷第 3 期182研究论著研究论著新医学 新医学 雷帕霉素对脱氢表雄酮诱导 PCOS 大鼠卵巢组织的影响及作用机制探讨陈文莉 王慧玲 杨君【摘要】目的探讨雷帕霉素对脱氢表雄酮(DHEA)诱导的多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢组织的影响及作用机制。方法55 只 SD 雌性大鼠适应性喂养 1 周后随机分为空白组(13 只)、对照组(13 只)及 PCOS 组(29 只),其中 PCOS 组大鼠皮下注射 DHEA 诱导建立 PCOS 大鼠模型,对照组大鼠给予皮下注射大豆油,空白组全程不做任何处理。造模成功后分为空白组、对照组(腹腔注
2、射等体积生理盐水),将 PCOS 大鼠分为模型对照组(腹腔注射等体积生理盐水)、低剂量组(腹腔注射雷帕霉素1mg/kg)及高剂量组(腹腔注射雷帕霉素10mg/kg),每组各8只大鼠,共干预 28d,给药结束后检测各组大鼠血糖、性激素水平,并进行 HE、Masson、免疫组织化学染色,检测并比较组间mTOR、p-mTOR 及 p-P70S6 蛋白表达,TUNEL 法检测卵巢组织凋亡情况。结果PCOS 大鼠动情周期出现紊乱,卵巢组织中卵泡呈现多囊样变化,PCOS 大鼠体重、卵巢质量、体积、相对质量、性激素水平、纤维化阳性范围均高于对照组(P 均 0.05),而低剂量组和高剂量组大鼠的上述指标均低于
3、模型对照组(P 均 0.05),且卵巢组织多囊样变化明显减轻。低剂量组与高剂量组的纤维化阳性范围较空白组及对照组增加、高剂量组较模型对照组增加(P 均 0.05)。模型对照组大鼠卵巢中 p-mTOR 蛋白的光密度(OD)值高于其他 4 组(P 均 0.05),而高剂量组低于空白组、对照组及低剂量组(P 均 0.05)。卵巢组织 TUNEL 染色结果分析,模型对照组高于空白组、对照组和高剂量组(P均0.005),空白组低于低剂量组(P 0.005)。结论雷帕霉素使 DHEA 诱导的 PCOS 大鼠模型体重、卵巢质量减轻,卵巢体积减少,性激素水平降低,卵泡组织中多囊样改变减轻及卵巢组织细胞凋亡减少
4、,这可能与雷帕霉素抑制 mTOR 信号通路的异常激活有关;但其也可能导致 PCOS 大鼠卵巢间质纤维化增加,大鼠体重、卵巢质量与体积低于正常水平。【关键词】多囊卵巢综合征;大鼠卵巢;脱氢表雄酮;雷帕霉素;丝氨酸/苏氨酸激酶The effect and mechanism of rapamycin on the ovarian tissue of rats with PCOS induced by dehydroepiandrosterone Chen Wenli,Wang Huiling,Yang Jun.Obstetrics and Gynecology,the First Affiliat
5、ed Hospital of Xinxiang Medical College,Weihui 453100,ChinaCorresponding author,Yang Jun,E-mail:【Abstract】Objective Toevaluatetheeffectandunravelthemechanismofrapamycinontheovariantissuesinratmodelswithpolycysticovarysyndrome(PCOS)inducedbydehydroepiandrosterone(DHEA).Methods After1-weekaccustomedfe
6、eding,55ratswererandomlydividedintotheblank(n=13),control(n=13)andmodelgroups(n=29).PCOSratmodelswereestablishedbysubcutaneousinjectionofDHEAsolution.Inthecontrolgroup,ratsweresubcutaneouslyinjectedwithsoybeanoil,whilethoseintheblankgroupwerenottreatedthroughoutthewholeexperiment.Afterthemodelwassuc
7、cessfullyestablished,allratsweredividedintotheblankgroup,controlgroup(intraperitonealinjectionofanequivalentvolumeofnormalsaline),themodelgroup,low-dosegroup(intraperitonealinjectionof1mg/kgrapamycin)andhigh-dosegroup(intraperitonealinjectionof10mg/kgrapamycin)for28d,8ratsineachgroup.Bloodglucoseand
8、hormonelevelsweredetected,andHE,Massonandimmunohistochemicalstainingwasperformedaftercorrespondinginterventions.ThechangesoftheexpressionlevelsofmTOR,p-mTORandp-P70S6wereassessedamongdifferentgroups.TUNELassaywasusedtodetecttheapoptosisofovariantissuesamongdifferentgroups.Results PCOSratsshowedirreg
9、ularestrouscycle,andthefolliclesweremanifestedwithpolycysticchanges.Thebodyweight,ovarianweight,volume,relativeweight,sexhormonelevelsandpositiveareaofovarianfibrosisofPCOSratswereallhigherthanthoseinthecontrolgroup(allP 0.05),whereastheseparametersinthelow-andhigh-dosegroupswerelowerthanthoseinthem
10、odelcontrolgroup(allP 0.05),基金项目:河南省科技发展计划(192102310068)作者单位:453100 卫辉,新乡医学院第一附属医院妇产科(陈文莉,王慧玲,杨君),生命科学院(陈文莉)通信作者,杨君,E-mail:DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2023.03.005欢迎扫码观看 文章视频简介20232023 年3 月第 54 卷第 3 期年3 月第 54 卷第 3 期183新医学 新医学 andthepolycysticchangesofovariantissuesweresignificantlymitigated.Theposit
11、iveareaofovarianfibrosisinthelow-andhigh-dosegroupswasincreasedthanthoseintheblankandcontrolgroups(allP 0.05).Thepositiveareaofovarianfibrosisinthehigh-dosegroupwasincreasedthanthatinthecontrolgroup(P 0.05).TheODvalueofmTORproteininthemodelcontrolgroupwashighercomparedwiththoseintheremainingfourgrou
12、ps(allP 0.05),whereastheODvalueofmp-P70S6proteininthehigh-dosegroupwaslowercomparedwiththoseintheblank,controlandlow-dosegroups(allP 0.05).TUNELstainingrevealedthattheapoptosisrateofovariantissuesinthemodelcontrolgroupwashigherthanthoseintheblank,controlandhigh-dosegroups(allP 0.005),whereastheapopt
13、osisrateintheblankgroupwaslowerthanthatinthelow-dosegroup(P 0.005).Conclusions Rapamycincanreducebodyweight,decreaseovarianmassandvolume,lowerhormonelevels,mitigatepolycysticchangesinfolliculartissuesandalleviateapoptosisofovariantissuesinDHEA-inducedPCOSratmodels,whichmayberelatedtotheinhibitionofa
14、bnormalactivationofmTORsignalingpathwaybyrapamycin.However,rapamycinmayaggravateovarianinterstitialfibrosisinPCOSrats.Thebodyweight,ovarianmassandvolumeofPCOSratsarelowerthanthenormallevels.【Key words】PCOS;Ovaryofrat;DHEA;Rapamycin;mTOR;Serine/threoninekinase多囊卵巢综合征(PCOS)是妇科最常见的生殖内分泌代谢性疾病之一,临床表现各不相同
15、,其主要特征为高雄激素血症、肥胖、月经稀发、月经紊乱、不孕或彩色多普勒超声(彩超)下呈多囊卵巢等11。PCOS 可增加糖尿病、心血管疾病及子宫内膜癌等疾病的风险22。目前 PCOS 的病因及发病机制尚未阐明,近年有研究表明 PCOS 的发生可能与 mTOR 信号通路有关33。哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,参与控制不同的应激源、激素、营养物质和生长因子,并在细胞增殖、代谢、生长和分化过程中发挥重要作用。Roa 等(2009 年)研究表明,mTOR 信号在控制雌性大鼠青春期开始、减少黄体生成素分泌和促性腺激素分泌等方面起着重要作用。近年来,有报道雷帕霉素可能通过抑制 m
16、TOR 信号通路异常激活,抑制始基卵泡的激活,从而保护卵泡储备功能44。但目前有关雷帕霉素对 PCOS 大鼠模型的影响鲜有报道,故本研究构建 PCOS 大鼠模型,并给予不同剂量雷帕霉素处理,探讨雷帕霉素对 PCOS 大鼠模型卵巢组织的影响及作用机制。材料与方法一、实验对象清洁级SD雌性大鼠,6周龄,体重(18010)g,购自山西医科大学实验动物中心。根据预实验模型构建及实验所需标本量的情况,确定样本量为55。大鼠分笼饲养,自由饮水、自由进食,饲养温度为2024,饲养环境湿度为40%60%,每日光照及黑暗时间各12 h。本研究经新乡医学院第一附属医院伦理委员会批准(批件号:2021009),并根
17、据国家卫生研究院实验动物使用指南进行相关操作。二、试剂与仪器脱氢表雄酮(DHEA)和雷帕霉素购自上海麦克林生化科技股份有限公司,医用大豆油购自浙江田雨山药用油有限公司,生理盐水购自石家庄四药有限公司,血糖仪购自三诺生物传感股份有限公司,血清睾酮、雌二醇、孕激素 ELISA 试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司,革兰染色试剂(快速法)购自珠海贝索生物技术有限公司,HE 和 Masson 染色剂试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司,一抗 mTOR 抗体、二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔购自武汉赛维尔生物科技有限公司,p-mTOR抗体购自英国Abcam公司,p-P70S6 抗体购自美国 Sant
18、a Cruz 公司。三、实验方法1.分组、构建 PCOS 大鼠模型及给药 1.分组、构建 PCOS 大鼠模型及给药 55 只大鼠适应性喂养 1 周后称重,采用随机区组法分组,即首先将大鼠根据体重分为 3 个区间,然后每个区间随机分为空白组(13 只)、对照组(13 只)及模型组(29 只)。空白组不做处理,每天上午8 0010 00对照组给予皮下注射0.2 mL大豆油溶剂,模型组同一时间予颈背部按60 mg/kg 的剂量皮下注射 DHEA 0.2 mL,连续注射 28 d,构建 PCOS 大鼠模型55。造模期间每日取大鼠阴道分泌物进行阴道涂片,观察大鼠动情周期的变化。造模结束后,分别从空白组、
19、对照组及模型组中20232023 年3 月第 54 卷第 3 期年3 月第 54 卷第 3 期184新医学 新医学 随机抽取 5 只大鼠,测定体重,检测血清性激素水平,并于麻醉下取双侧卵巢组织观察卵巢形态的变化,评价造模效果。造模成功定义为体重增加,动情周期紊乱(大鼠动情周期 4 个阶段未按照顺序进行,或处于非动情期),血清睾酮水平升高,卵巢质量及体积增加,卵巢组织中几乎无正常卵泡,并且卵泡呈现多囊样改变。造模成功后将模型组剩余 24 只大鼠分为模型对照组、低剂量组、高剂量组各 8 只。低剂量组每日给予腹腔注射生理盐水和雷帕霉素1 mg/kg,高剂量组每日给予腹腔注射生理盐水和雷帕霉素10 m
20、g/kg,模型对照组及对照组予腹腔注射等体积生理盐水。2.观察各组大鼠动情周期的变化2.观察各组大鼠动情周期的变化每日清晨取大鼠阴道分泌物涂抹于酒精擦拭的载玻片上,待自然风干后,进行快速革兰染色,在显微镜下观察阴道涂片的细胞类型:动情前期主要是白细胞为主,动情期主要是有核上皮细胞为主,动情后期主要是无核角化细胞为主,动情间期以上 3 种细胞均存在66。3.监测大鼠血糖及血清激素水平的变化3.监测大鼠血糖及血清激素水平的变化造模 28 d 后及给药结束后,禁食水 12 h 后于大鼠尾静脉取血后采用血糖仪检测血糖,麻醉后开腹暴露腹主动脉,抽取 24 mL 动脉血,离心分离血清后分装于 EP 管内-
21、20冰箱保存备用。采用 ELISA 法按试剂盒说明书步骤测定血清孕激素、睾酮、雌二醇水平。4.监测大鼠体重及卵巢质量、体积及相对质4.监测大鼠体重及卵巢质量、体积及相对质量的变化量的变化研究过程中每 3 d 清晨监测 1 次大鼠体重并记录,根据数值变化绘制体重变化图。研究结束时麻醉大鼠,腹主动脉取血后处死,摘取双侧卵巢,称重,放置于冰面上测量卵巢的长度、宽度及厚度,计算卵巢体积(长度 宽度 厚度)及卵巢相对质量 质量(mg)/体积(mm3),置于 4%甲醛中以备后续制作石蜡切片77。5.HE 染色法观察卵巢形态学变化5.HE 染色法观察卵巢形态学变化卵巢组织经常规固定、脱水、浸蜡、包埋,制作石
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