聚乙二醇单分子的界面扩散_...单分子轨迹追踪测量的一致性_李卓.pdf
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1、聚乙二醇单分子的界面扩散:荧光关联光谱与单分子轨迹追踪测量的一致性李卓1,2,陈阔1,2,侯天昊1,2,杨京法1,2,赵江1,2*1.北京分子科学国家研究中心,中国科学院化学研究所,北京 1001902.中国科学院大学,北京 100049*通讯作者,E-mail:收稿日期:2022-12-28;接受日期:2023-02-10;网络版发表日期:2023-03-15国家自然科学基金(编号:21833012)资助项目摘要高分子表界面的扩散运动在决定体系流变学性质、界面化学反应速率、相分离及其动力学、生物功能与信号传导等方面发挥着关键作用,因而,有效、准确地测量表界面处单个高分子的扩散运动具有十分重要
2、的意义.本文以荧光关联光谱、单分子荧光轨迹追踪技术为手段,以吸附于固液界面的聚乙二醇(PEO)分子为模型体系,对上述两种研究方法进行了详细的比较.结果表明,虽然两种方法原理不同,覆盖的时间窗口不同,测量空间范围不同,但是在合适的测量时间窗口内对理想界面(水/硅烷化单晶薄膜的界面)处的PEO单分子扩散运动进行测量,获得了一致的扩散系数结果,表明了两种研究方法对理想界面处单分子扩散测量的准确性与可靠性.关键词界面扩散,荧光关联光谱,单分子轨迹追踪,关联函数,方均位移1引言自然界中表面与界面是最为普遍存在的形态与现象,众多物质、结构、过程、功能都与表界面相关1.与此同时,表界面高分子的性质是高分子物
3、理领域的重要课题,其中的物理原理将帮助我们认识与理解诸多重要的自然现象、工业过程,能够帮助我们设计与制造新材料,发展新原理,发明新技术2.在过去几十年中,关于表界面高分子的研究一直吸引着大量的研究力量.由于热激发的存在,处于表界面的分子时时刻刻都在进行着运动,包括平动、转动、振动等运动模式.在多重动态模式并存的动力学过程中,高分子的平动扩散运动被视为其最初级的动力学过程,因此,关于表界面高分子单链扩散运动的研究对于揭示重要的表界面现象与过程具有十分重要的意义,如高分子流变学、相分离动力学、界面反应动力学、生物功能及信号传导等3.关于表界面高分子动力学的研究一直备受关注,人们试图以各种可能的方法
4、开展相关的研究4.然而,表界面单分子扩散运动的观察与测量颇具难度,传统的研究方法缺乏足够高的灵敏度与信噪比,因而难以准确地捕捉界面单分子的信息5.目前,能够有效、无扰地测量表界面单个高分子扩散运动的有效方法主要以单分子荧光显微与光谱方法为主,其中包含两个重引用格式:Li Z,Chen K,Hou T,Yang J,Zhao J.Interfacial diffusion of single polyethylene oxide molecules:the consistency between fluorescence correlationspectroscopy and single mo
5、lecule fluorescence tracking.Sci Sin Chim,2023,53:762767,doi:10.1360/SSC-2022-0249 2023 中国科学杂志社中国科学:化学2023 年第 53 卷第 4 期:762 767SCIENTIA SINICA C聚合物结构与性能专刊论 文要方法:荧光关联光谱68和单分子轨迹追踪911.荧光关联光谱方法利用涨落统计光谱原理,以共聚焦显微技术为基础,在单光子计数的灵敏度下,获取扩散运动所导致的共聚焦空间中的荧光信号涨落,进而获取其关联函数,并通过对其进行数值拟合而获得被测量分子的扩散系数及平均浓度.单分子荧光轨迹追踪方法以
6、单分子荧光显微成像技术为基础,通过高灵敏的影像摄取而测量单个分子的空间位置,实现对单个分子的运动轨迹及其随时间的演变,进而获得其扩散系数的数值.由于测量原理及软硬件的差别,荧光关联光谱与单分子轨迹追踪技术各有特点,其适合测量的体系与时间窗口也不尽相同.荧光关联光谱采用激光共聚焦技术,将采样测量空间定位于被测量区域,能够测量不同维度的扩散运动与定向运动.同时由于其具备单光子计数的探测能力,因而拥有很高的灵敏度与时间分辨率12.单分子轨迹追踪方法则基于显微成像技术,能够直观、准确地记录单个分子的坐标与运动轨迹.由于该技术要求对被研究区域进行单分子级别的大范围成像,对微弱光信号的面探测技术具有较高要
7、求,因而其时间分辨率决定于探测技术水平,而目前的技术则决定该方法适合于测量相对较慢的扩散运动13.正是由于原理及方法上的巨大差别,人们对于这两种方法测量数据的彼此认可度一直未能有明确的结论,而且还存在着不少争论.例如,有研究人员认为在荧光关联光谱的测量中可能包含着界面分子吸附与脱附的过程而非理想的平动扩散14;有研究人员认为由于成像速度的影响,单分子轨迹追踪测量的是慢速运动的分子而忽略了在理想表界面处进行高速扩散运动的分子:这些分子由于处于不存在缺陷、近乎理想的表界面,其扩散运动速率超越了单分子荧光成像技术的时间分辨率15.基于两种研究方法的差异以及相关争论的存在,同时鉴于二者在测量表界面扩散
8、运动中的重要性,有必要对这一议题进行研究与论证.如果能够设计与制备合适的研究体系,使得两种研究方法能够进行同步测量从而实现有效的比较,无疑具有重要的意义与价值.这样的研究不仅能够澄清人们关于二者之间的误解,更重要的是能够帮助研究人员有效地采用合适的研究方法,准确客观地实施测量.基于这一出发点,本文以疏水硅烷分子自组装薄膜覆盖的二氧化硅平面为表面,以聚乙二醇(PEO)为被测量模型分子,分别采用荧光关联光谱和单分子荧光轨迹追踪技术,对吸附于水与上述薄膜界面的单个PEO分子的平动扩散运动进行测量与研究,有效地比较了两种研究方法在测量表界面分子扩散运动的异同.2实验部分实验采用被十八烷基三乙氧基硅烷(
9、OTE)分子自组装单分子膜覆盖的熔融石英作为表面,以荧光标记的PEO分子为模型体系,分别采用荧光关联光谱与单分子轨迹追踪技术,测量从水溶液中吸附于水/OTE界面的PEO分子的横向界面扩散运动.2.1试剂与仪器OTE购自美国Alfa Aesar公司,PEO购自美国Na-nocs公司,其分子量分别为10103与40103g/mol,其Mw/Mn值介于1.03与1.07之间.活性荧光分子Alexa647购自美国ThermoFisher公司,熔融石英基片购自美国ESCO Products公司,去离子水(18.2 M cm)由美国Milli-Q纯水仪制备.Langmuir-Blodgett(LB)制膜机
10、为瑞典的KSVNIMA,原子力显微镜为美国布鲁克公司的Multimode8,荧光关联光谱实验装置为基于德国Karl Zeiss公司的LSM780激光扫描共聚焦显微镜,使用其40倍水浸物镜(数值孔径为1.2),以633 nm激光作为激发光源.在实验中,通过使用已知扩散系数及浓度(Alexa 647,在25条件下,扩散系数为330 m2/s,配制得到的浓度为5.0109mol/L)的标准样品进行校准,测量得到其共聚焦空间的横向半径约为0.28 m,纵向半高度约为1.46 m.单分子荧光成像及轨迹追踪实验装置为自行搭建,使用日本奥林巴斯IX-71显微镜为平台,使用100倍油浸物镜(数值孔径为1.49
11、),以639 nm固体激光为激发光源,采用全内反射模式实现激发与成像,图像由EMCCD相机收集与记录(英国Oxford Instruments,iXon Ultra)16.2.2实验方法OTE单分子自组装薄膜采用LB膜方法制备17.在实验中,OTE及其溶剂氯仿均经过减压蒸馏纯化,随后中国科学:化学2023 年第 53 卷第 4 期763配制浓度为2.0 mg/mL的溶液.将20 L溶液滴加在LB制膜机的液相(pH值为2.0的稀硝酸)表面,滴加溶液的体积根据LB制膜机液槽面积计算得到.静置30 min,使得滴加溶液中的溶剂挥发完毕且硅烷化试剂充分水解,之后驱动LB制膜机的横梁,使得体系的表面压达
12、到26.0103N/m,并在维持该表面压的条件下,将液相表面的单分子薄膜(Langmuir膜)转移至固态石英基片上.之后将基片置于120的真空中退火处理10 h18.PEO的荧光标记通过将活性荧光分子Alexa 647与PEO分子链末端的活性基团反应而实现,反应完成后,通过体积排阻层析柱进行提纯19.为了实现PEO在水/OTE界面的吸附,首先配制浓度为1010mol/L的PEO稀薄溶液,随后将其滴加于被OTE单分子薄膜覆盖的基片表面,在20静置12 h后再进行去离子水交换,以去除溶液中残留的PEO分子.随后样品被放置于显微镜样品台上,通过仔细调节物镜的位置而确保其焦点与样品界面重合,或确保显微
13、成像的激发光与焦平面都与界面重合.单分子荧光成像实验的时间分辨率为50 ms/帧,拍摄长度约为300400帧,图像分析及轨迹追踪采用IDL语言编写的程序20.3结果与讨论采用LB膜技术制备并经退火稳定后的OTE单分子薄膜的平均厚度为2.1 nm,其表面形貌如图1所示.OTE单分子薄膜的表面由大量近似圆形的单晶畴区覆盖,畴区的尺寸为713 m,表面粗糙度为0.2 nm,单晶畴区内部很平整,近乎为理想表面.OTE薄膜的表面大部分被单晶畴区覆盖,而单晶畴区的尺寸远大于荧光关联光谱的共聚焦空间尺寸(直径约为0.56 m,为单晶畴区的1/23至1/13),因此,当进行荧光关联光谱测量时,共聚焦空间与单晶
14、畴区重叠的概率很高,能够大概率地实现单晶表面的分子扩散测量.采用荧光关联光谱对吸附于水/OTE界面的PEO单分子横向扩散运动测量时,通过调节显微物镜的位置,实时监控仪器的单分子荧光光子计数,发现在溶液中仅存在很低的背景光,而在焦点与界面重合时,则出现了远高于背景光水平的荧光强度19,这种现象帮助我们实现了焦点与界面的准确定位16.图2为PEO-10k与PEO-40k在水溶液及水/OTE界面处扩散运动的归一化关联函数.对于二维平动布朗运动,其关联函数可以表达为()()GwDw()=1+4/(1)2D021021其中w0为共聚焦空间的横向半径,为界面浓度,D为扩散系数21.数值拟合的结果表明,PE
15、O-10k、PEO-40k的单链界面扩散系数分别为0.13和0.06 m2/s.这些数值远低于PEO在水溶液中的扩散系数(PEO-10k:74.3 m2/s,PEO-40k:42.0 m2/s),这表明PEO分子与固体OTE表面的疏水相互作用使得其受到的来自于固体表面的阻力远大于来自于液态水的流体力学阻力.实验结果还显示,界面处PEO分子的平均数量浓度介于837 m2之间,因而其对应的分子间平均距离均大于158 nm(以数量浓度为40 m2计算),远大于单个PEO分子的大小,表明PEO分子链在疏水单层分子膜上以单链形态存在并进行扩散运动,分子间相互作用可以忽略,从而满足独立布朗运动的条件22.
16、采用单分子荧光成像方法拍摄的PEO-10k在水/OTE界面处扩散运动的影像以及通过单分子轨迹追踪获得的方均位移(mean square displacement,MSD)随时间延时的数据均见网络版补充材料.同一样品的平均方均位移随时间延时的数据如图3所示.以布朗运动的方均位移与时间延时的相互关系:rD=4(2)2对数据进行数值拟合(图3中的直线为拟合结果),可以看到数据体现了PEO分子的界面运动具有良好的布朗运动特征,表明在OTE单晶畴区满足理想表面的条件.数值拟合得到的PEO-10k、PEO-40k的界面扩散系数分别为0.16和0.04 m2/s.图 1OTE自组装单分子薄膜的表面形貌(采用
17、原子力显微镜观察)(网络版彩图)Figure 1The surface morphology of self-assembled monolayer ofOTE as observed by atomic force microscope(color online).李卓等:聚乙二醇单分子的界面扩散:荧光关联光谱与单分子轨迹追踪测量的一致性764将荧光关联光谱、单分子荧光轨迹追踪测量得到的PEO分子在水/OTE界面处的横向扩散运动结果比较(表1),可以看到两种方法测量得到的结果十分接近,表明虽然两种研究方法的原理不同,测量区域不同,时间分辨率不同,但是针对同一扩散运动过程的测量结果相同,表明这
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