两种养殖模式金背鲤肠道微生物菌群和主体风味差异分析_于美娟.pdf
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1、DOI:10.12131/20220270文章编号:2095 0780(2023)03 0151 13两种养殖模式金背鲤肠道微生物菌群和主体风味差异分析于美娟1,2,杨 慧1,余长生2,3,蔡教明3,补子龙3,曾宪文31.湖南省农业科学院农产品加工研究所,湖南 长沙 4101252.湖南省水产产业技术体系,湖南 长沙 4101253.湖南省怀化市畜牧水产事务中心,湖南 怀化 418000摘要:探讨不同养殖模式下金背鲤(Cyprinus carpio var.Jinbei)肠道菌群和鱼肉风味品质差异,对金背鲤的繁殖优化具有重要意义。采用高通量测序技术对稻田放养和池塘养殖模式下金背鲤的肠道微生物进
2、行测序,利用液相色谱和顶空固相微萃取-气相色谱-离子迁移谱联用(HS-SPME-GC-IMS)技术测定其滋味物质、挥发性风味化合物,结合感觉阈值计算滋味活性值和相对气味活度值。结果显示:两种养殖模式的金背鲤肠道细菌群落结构差异显著,稻田放养(FGF)组以弧菌(Vibrio)、拟杆菌(Bacteroides)、交替单胞菌(Alteromonadales)、希瓦氏菌(Shewanella)、嗜冷假单胞菌(Pseudomonas psychrophile)和Brevinema属为主,池塘养殖(FGP)组以莫拉克斯氏菌(Moraxella)和克雷伯菌属(Klebsiella)为主;FGF组中鲜味肌苷酸
3、含量及其滋味活性值(1.676 gkg1,6.705)远高于FGP组(0.246 gkg1,0.985),FGF组鲜味氨基酸和甜味氨基酸含量(0.143和2.052 gkg1)高于FGP组(0.109和2.001 gkg1),而其苦味氨基酸(3.193 gkg1)却低于FGP组(3.836 gkg1);金背鲤的挥发性化合物组分复杂,其关键气味化合物(ROAV1)和对整体风味有修饰作用的化合物(0.1ROAV1)的种类存在差异。菌属与风味物质的相关性分析显示弧菌属、拟杆菌属、克雷伯菌属和摩根菌属(Morganella)与风味物质呈显著相关(0.01P0.05&0.001P0.01&P0.001)
4、。研究表明,养殖模式影响了金背鲤的肠道微生物,并间接影响了其风味品质。关键词:金背鲤;稻田放养;池塘养殖;肠道菌群;主体风味物质中图分类号:TS 254.2文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OSID):Analysis on differences of microbial community structure and main flavorsubstances of Cyprinus carpio var.Jinbei cultured in paddy fields and pondsYU Meijuan1,2,YANG Hui1,YU Changsheng2,3,CAI Ji
5、aoming3,BU Zilong3,ZENG Xianwen31.Agricultural Products Processing Institue,Hunan Academy of Agricultural Sciences,Changsha 410125,China2.Technology System of Aquatic Industry in Hunan Province,Changsha 410128,China3.Huaihua Animal Husbandry and Fishery Affairs Center,Huaihua 418000,ChinaAbstract:It
6、 is important to study the differences of intestinal flora and fish flavor quality of Cyprinus carpio var.Jinbei underdifferent culture modes for its breeding optimization.We applied illumina high-throughput sequencing technology to analyzeintestinal microflora of C.carpio var.Jinbei cultured in pad
7、dy fields(FGF)and ponds(FGP),respectively.Besides,we used li-quid chromatography(LC)to determine the flavor substances,and used headspace solid phase microextraction combining withgas chromatography-ion mobility spectrometry(HS-SPME-GC-IMS)to determine the volatile flavor substances.Then we calcu-la
8、ted the taste activity value and relative odor activity by combining the sensory threshold.Significant difference analysisshows that Vibrio,Bacteroides,Alteromonadales,Shewanella,Pseudomonas psychrophila and Brevinema were the main bacteria第 19 卷第 3 期南 方 水 产 科 学Vol.19,No.32023 年 6 月South China Fishe
9、ries ScienceJun.,2023收稿日期:2022-10-12;修回日期:2022-12-30基金项目:湖南省现代农业水产产业技术体系岗位专家专项资金(湘农发 2019105 号);湖南省自然科学基金(2020JJ4392)作者简介:于美娟(1976),女,研究员,硕士,研究方向为水产品加工与综合利用。E-mail:in FGF group,while Moraxella and Klebsiella were the main bacteria in FGP group.The contents of IMP and flavor activity inFGF group(1.67
10、6 gkg1 and 6.705)were significantly higher than those in FGP group(0.246 gkg1 and 0.985).The contents ofumami amino acids and sweet amino acids in FGF group(0.143and 2.052 gkg1)were higher than those in FGP group(0.109and 2.001 gkg1).However,the contents of bitter amino acids in FGF group(3.193 gkg1
11、)were lower than those in FGP group(3.836 gkg1).Moreover,the components of volatile compounds were complex,and the types of key odor compounds(ROAV1)and compounds that could modify the overall flavor (0.1ROAV1)were different.The correlationanalysis between bacteria genera and flavor substances shows
12、 that Vibrio,Bacteroides,Klebsiella and Morganella were signific-antly correlated with flavor substances(0.01P0.05&0.001P0.01&P0.001).The results indicate that cultivation modeaffects the intestinal microbes of fish,and affects the flavor quality of fish indirectly.Keywords:Cyprinus carpio var.Jinbe
13、i;Paddy field culture;Pond culture;Intestinal bacterial flora;Main flavor substances稻渔综合种养模式是在我国传统稻田养鱼的基础上,利用互利共生原则建立起来的多物种共栖、多层次利用的一种新型农业模式1-2。这种养殖模式可以减少农药化肥的使用,提高水稻和鱼类品质,实现“一田两用”。金背鲤(Cyprinus carpiovar.Jinbei,暂定名)因具有独特的“金背金额”外观特征而得名,是湘西地区在长期稻田养鱼过程中形成的鲤鱼地域性品种,其生长速度快于本地鲤,而且肉质厚实、口感鲜美,深受消费者的喜爱。稻田养殖实现了
14、多物种共栖,既可为养殖鱼类提供天然饵料,且其低养殖密度也可改善水质,促进鱼类生长,并提升鱼类的品质3-4。有研究报道,鱼类肠道微生物是动态变化的,其群落结构受养殖模式和水体环境等因素的影响5。良好的养殖模式会提升水产动物的营养与风味品质6。如张艳霞等7研究发现普通网箱养殖的大黄鱼(Larimich-thys crocea)鱼腥味、哈喇味及青草味较重,而大围网箱养殖的则蘑菇味、脂香味、果香味较强。水产品的风味由气味和滋味两部分组成,它们可以通过复杂的气味协同、累加、掩盖、融合作用以及滋味的变调、对比、消杀、相乘作用相互影响,形成独特的风味8。目前有关金背鲤的研究报道非常有限,探讨不同养殖模式下金
15、背鲤肠道菌群和鱼肉风味品质的差异,对下一步金背鲤的繁殖优化具有重要意义。本文采用高通量测序技术,对稻田和池塘养殖模式下金背鲤肠道微生物进行测序,同时利用液相色谱(LC)测定滋味物质、顶空固相微萃取-气相色谱-离子迁移谱联用技术(HS-SPME-GC-IMS)测定挥发性风味物质,结合感觉阈值与呈味、气味特征,计算滋味活性值和相对气味活度值,分析不同养殖模式下金背鲤的肠道菌群结构和菌群的差异及主要风味物质特征差异性,以为金背鲤下一步的选育繁殖提供研究方向,并为完善和推广稻田养殖模式提供参考数据。1 材料与方法 1.1 试剂核苷酸标准物质(纯度99%,美国药典 USP标准品);24 种氨基酸标准品(
16、17 种氨基酸为混合标准品 2.5 molmL1,其他为分析纯,Sigma);DNA 凝胶回收试剂盒(Qiagen 公司);TruSeq 文库构建试剂盒、MiSeq 测序试剂盒(美国 Illumina 公司);溶菌酶(美国 BBI 公司)。1.2 主要仪器设备SynergyHTX 多功能酶标仪(美国 BioTe Tek 公司);Illumina HiSeq 测序仪(美国 Illumina 公司);1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);1100 液相色谱仪(美国安捷伦公司);FlavourSpec风味分析仪(山东海能科学仪器有限公司)。1.3 方法1.3.1样品采集与处理样品采集辰溪县凤凰山
17、农业公司池塘养殖(FGP)组和稻田基地养殖(FGF)组,同一批次放养、体型大小相似的金背鲤,用冲氧袋运送至实验室,在 FGP 和 FGF 组随机各选 5 尾,在无菌状态下取出整个肠道,采集肠道内容物置于无菌的离心管中,液氮速冻,80 保存,用于提取总 DNA。另外鱼放入塑料桶中静养 12 h 后,各取 5 尾,剖杀后去鳞、内脏、皮等,手工取全鱼肌肉,搅碎机绞碎成均匀肉糜后分装,40 冻藏备用。1.3.2肠道微生物高通量测序分析取肠道样本(80 冰箱冻存)放置在冰块上解冻,放入研钵后加入液氮研磨至粉末,使用预先152南 方 水 产 科 学第 19 卷冷冻处理的 2 mL 离心管,称量约 100
18、mg 样本进行总 DNA 提取。然后用乙醇沉淀纯化和 1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测所提取的 DNA 浓度和纯度,送百迈客生物公司使用 Illumina Hiseq2500 高通量测序平台进行测序分析。采用软件 USEARCHversion 10.09进行 OTU 分析,Mothurversionv.1.3010进行 Alpha 指数分析。通过 RDP Classifier11(置信度阈值为 0.8)进行物种注释,并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成。使用 LefSe 进行组间差异显著性分析。1.3.3核苷酸分析采用高效液相色谱仪分析核苷酸。样品采用10%(质量分数)高氯酸溶液提取,提
19、取液调节pH 为 6.8,过 0.22 m 滤膜上机测定,记录峰面积,响应值均应在仪器检测的线性范围之内,根据标准品的保留时间定性,外标法定量。1.3.4游离氨基酸分析采用 Agilent1100 液相色谱仪进行分析。称取0.50 g 样品于 10 mL 离心管中,加 0.01 molL1 盐酸 5 mL,混匀,沸水浴 30 min,离心取上清液,沉淀再加 2 mL 0.01 molL1 盐酸悬浮超声 5 min 后离心,合并上清液,定容至 10 mL,过膜上机,通过安捷伦公司自动在线衍生化方法,比较游离氨基酸标准品的保留时间和峰面积来计算样品中游离氨基酸含量。1.3.5滋味活性值(Taste
20、activityvalue,TAV)的计算TAV 表示各呈味物质的浓度与该物质的阈值之比。参考徐永霞等12的方法,计算不同养殖模式下金背鲤肌肉中各游离氨基酸和核苷酸的 TAV。1.3.6挥发性化合物分析称取 2.0 g 金背鲤肌肉样品置于一个 20 mL 顶空进样瓶中,在 60 下孵育 15 min,随即用配置CTC 多功能自动进样器和注射器的 GC-IMS(Fla-vour Spec-G.A.S.,德国)在不分流模式下进行后续分析。测试条件:采用FS-SE-54-C4-CB-1(15 m0.53 mm)色谱柱,柱温 60,N2为载气,流速 150 mLmin1,IMS温度45;2 mLmin
21、1维持至20 min,100 mLmin1维持至 30 min,总运行 30 min。采用 LAV 软件2.2.1(G.A.S.,德国)采集和处理 GC-IMS 数据,NIST和 IMS 数据库来对挥发物进行定性。每个样品中加入 10 L 4-甲基-2 戊醇(20106)内标物计算各挥发性成分的相对含量。1.3.7相对气味活度值(Relativeodoractivityvalue,ROAV)法评价采用 ROAV 法 13的计算公式如下:ROAViCriCrstanTstanTi100%(1)式中:Cri 为各挥发性组分的相对百分含量(%,质量比);Crstan为对样品总体风味贡献最大组分的相对
22、含量(%,质量比);Tstan 为对样品总体风味贡献最大组分相对应的感觉阈值(gkg1);Ti 为各挥发性组分相对应的感觉阈值(gkg1)。1.4 数据处理X通过 Excel 2010 和 SPSS 22.0 软件对数据进行统计分析,分析结果以“平均值标准误(SE)”表示。采用 SPSS Statistics 23.0 软件的方差分析(ANO-VA,P0.05)。说明稻田196122469稻田放养组FGF池塘养殖组FGP图1 两种养殖模式的金背鲤肠道菌的特征韦恩图Fig.1 Venn diagram of features of intestinal bacteria inC.carpio v
23、ar.Jinbei of FGF and FGP groups第 3 期于美娟等:两种养殖模式金背鲤肠道微生物菌群和主体风味差异分析153放养组在物种丰富度和均匀度上优于池塘养殖组,但无显著性差异。2.1.2菌群结构组成差异性分析对样本中相对丰度大于 1%的 OTU 进行相对丰度和差异分析。如图 3 所示,在生物学分类门水平上,两组养殖模式检出 4 个门水平,分别为变形菌门、梭杆菌门、厚壁菌门和拟杆菌门,相对丰度大于 96%,这与黄颡鱼(Pseudobagrus vachell)14、草鱼(Ctenopharyngodon idella)15和罗非鱼(Oreo-chromis mossambi
24、cus)16肠道菌的结果一致。虽然养殖模式未改变优势菌门的种类,但影响了其相对丰度14。根据图 3 的单因素方差分析可知,除厚壁3004005006007000.83ACE 指数 ACE indexChao1 指数 Chao1 index3004005006000.33稻田放养 FGF池塘养殖 FGP2.02.53.03.50.73香农-威纳指数 Shannon index 辛普森指数 Simpson index0.260.50.60.7稻田放养 FGF池塘养殖 FGP稻田放养 FGF池塘养殖 FGP稻田放养 FGF池塘养殖 FGP组别 Group组别 Group图2 两种养殖模式的金背鲤肠道
25、微生物Alpha多样性指数Fig.2 Alpha diversity of intestinal microorganisms in C.carpio var.Jinbei of FGF and FGP groups物种相对丰度Relative abundance of species/%20406080100 00.000 10.0010.010.11相对丰度Relative abundance/%变形杆菌门Proteobacteria其他 Others厚壁菌门Firmicutes拟杆菌门Bacteroidetes梭杆菌门Fusobacteria拟杆菌门Bacteroidetes厚壁菌门Fi
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