肠出血性大肠埃希氏菌致病机制研究进展_杨小平.pdf
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1、第 14 卷 第 11 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.11 2023 年 6 月 Journal of Food Safety and Quality Jun.,2023 基金项目:国家市场监督管理总局科技计划项目(2020MK131)Fund:Supported by the State Administration for Market Regulation(2020MK131)*通信作者:曾慧君,博士,高级工程师,主要研究方向为食品微生物检测。E-mail:*Corresponding author:ZENG Hui-Jun,Ph.D,Senior En
2、gineer,Wuhan Institute of Food and Cosmetic Control,No.1137 Jinshan Avenue,Dongxihu District,Wuhan 430040,China.E-mail: 肠出血性大肠埃希氏菌致病机制研究进展 杨小平,郦 娟,虞伟明,陈 琼,曾慧君*武汉食品化妆品检验所,国家市场监管重点实验室(食用油质量与安全),武汉 430040 摘摘 要要:肠出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)是一类能引起轻则水样腹泻、重则溶血尿毒综合征的重要肠道致病菌。EHEC 通过感知定
3、殖部位的生物素和核酸浓度、各种物理信号(温度、pH、渗透压)等完成定殖,随后通过型分泌系统、黏附素等效应蛋白完成对宿主的黏附并造成黏附/脱落损伤,本文对上述内容进行总结,并介绍了志贺毒素的分子生物学特征、受体特异性及致病机制,最后阐述了 EHEC如何通过志贺毒素实现免疫逃逸及其在体内的毒力调控机制。通过对 EHEC 致病机制的总结与解析,提示我们需要防范和警惕因基因水平转移而产生的新血清型,感染 EHEC 可能的促癌效应;同时不要忽视快乐的情绪、正常的肠道菌群对 EHEC 的抑制作用。最后需要通过对 EHEC 的深入研究,加强对志贺毒素的改造和利用,使其发挥正向作用。本文旨在确定 EHEC 防
4、控的关键点,为食品安全监管提供方向。关键词关键词:肠出血性大肠埃希氏菌;定殖;黏附;志贺毒素;免疫逃逸;毒力调控 Advance in enterohemorrhagic Escherichia coli pathogenic mechanism YANG Xiao-Ping,LI Juan,YU Wei-Ming,CHEN Qiong,ZENG Hui-Jun*Wuhan Institute of Food and Cosmetic Control,Key Laboratory of Nationl Market Supervision (Edible Oil Quality and Saf
5、ety),Wuhan 430040,China ABSTRACT:Enterohemorrhagic Escherichia coli(EHEC)is a kind of important intestinal pathogenic bacteria that can cause watery diarrhea at mild level and hemolytic uremic syndrome at severe level.Firstly,EHEC completes colonization by sensing the concentration of biotin and nuc
6、leic acid in the colonization site,and various physical signals(temperature,pH,osmotic pressure);then EHEC accomplishes adhesion to the host and causes adhesion/exfoliation damage through effector proteins from type III secretory system.This paper summarized the above content,introduced the molecula
7、r biological characteristics,receptor specificity and pathogenic mechanism of Shiga toxin.Finally,this paper described how EHEC realizes immune escape through Shiga toxin and its virulence regulation mechanism in vivo.Through the analysis of the pathogenic mechanism of EHEC,it is suggested that we n
8、eed to prevent and be alert to the new serotypes generated by gene horizontal transfer and the possible cancer-promoting effect of EHEC infection,at the same time,dont ignore the inhibition of happy mood and normal intestinal flora on EHEC.Finally,through in-depth research on EHEC,we need to strengt
9、hen the transformation and utilization of Shiga toxin to make it play a positive role,guide vaccine research and development,immunotherapy,and the formulation of clinical treatment plans.Determine the key points of EHEC prevention and control through the study of pathogenic mechanisms,and provide di
10、rection for food safety supervision.DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2023.11.006第 11 期 杨小平,等:肠出血性大肠埃希氏菌致病机制研究进展 141 KEY WORDS:enterohemorrhagic Escherichia coli;colonization;adhere;Shiga toxin;immune escape;virulence regulation 0 引 言 致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenic Escherichia coli,DEC)是一类主要以引起人类腹泻症状的大肠埃希氏菌,常见
11、的DEC 包括:(1)肠致病性大肠埃希氏菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)、(2)肠产毒性大肠埃希氏菌(enterotoxigenic E.coli,ETEC)、(3)肠侵袭性大肠埃希氏菌(enteroinvasive E.coli,EIEC)、(4)产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing E.coli,STEC)或肠出血性大肠埃希氏菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC)、(5)肠聚集性大肠埃希氏菌(enteroaggregative E.coli,EAEC)和(6)弥 散 黏 附 性 大 肠 埃 希 氏 菌(d
12、iffusely adherent E.coli,DAEC)1。EHEC 是一种最典型的致泻大肠埃希氏菌,具有爆发流行快、致死性强和抗生素治疗不当可加剧病情的危险性等特点,临床感染中由 EHEC 引发的症状轻重不一,包括水样腹泻、出血性结肠炎、血小板减少性紫癜及致命的溶血尿毒综合征2,给患者健康造成巨大风险。常规微生物培养法检验周期较长,目前发展迅猛的快速检验方法为可视化-环介导等温扩增法3,该方法特异性和敏感性良好、结果可视、操作更简便。产志贺毒素大肠埃希氏菌是一群重要的肠道致病菌,目前至少有 100 多种血清型的大肠埃希氏菌具有产志贺毒素的能力,常见的血清型为 O157:H7 和 O157
13、:NM(无动力型),O157:H7/NM 也是我国食品安全监督抽检和风险监测中需重点关注的致病菌指标,深入了解 EHEC 的致病过程及致病机制对于由 O157:H7/NM 引发的食源性疾病防控具有重要的指导意义。本文综述了 EHEC 在定殖和黏附这两个入侵过程中,如何通过志贺毒素和免疫逃逸实现其高致病性,从而解析其致病机制,为监督抽检指明方向,使监督抽检工作更加有的放矢。1 EHEC 定殖 EHEC 主要通过被污染的食物或水进入人体消化道,最终在人体的肠道内定殖和引发感染,但在迷宫一样的肠道内如何选择定殖及感染位点,EHEC 在进化过程中形成了其独特的定殖方式。1.1 EHEC 通过感知生物素
14、浓度定殖和感染大肠 与沙门氏菌特异性定殖于小肠不同4,EHEC 特异性定殖和感染大肠。EHEC 通过感知大肠中低生物素浓度进行定殖和感染5,在该感知通路中,生物素蛋白连接酶BirA 和全局性调节因子 Fur 调节 EHEC 中肠细胞消失位点(locus of enterocyte effacement,LEE)区域基因的表达,当生物素达到一定浓度,EHEC 的 LEE 基因表达被抑制,反之 LEE 基因则表达增加。与大肠相比,小肠中的生物素水平预计会更高6,大肠中生物素浓度低,EHEC 通过感知大肠中低浓度生物素,增加 LEE 基因表达,提高细菌吸附定殖大肠上皮细胞的能力。1.2 EHEC 通
15、过感知核酸浓度差异定殖和感染大肠 小肠是人体的消化吸收器官,负责泌别清浊,其内含有大量的核酸7,而在大肠中肠道菌群通过某种机制吸收核酸分子并将其分解为脱氧核糖核苷酸,用于自身的生长繁殖,因此核酸含量相对较低8。EHEC 通过感知肠道中核酸的浓度差异,精确调控致病基因的表达,促进其在大肠中的定殖。这一过程主要依赖于转录调节蛋白 DeoR 和一个噬菌体 CP933V 编码的 sRNA(Esr055),Esr055 作为EHEC 毒力抑制因子负调控志贺毒素基因和型分泌系统2 相关基因的表达,在高浓度核酸条件下,DeoR 直接结合于 Esr055 的启动子区促进其转录能力,进而抑制相关致病基因的表达,
16、在大肠中则与之相反9。1.3 EHEC 感知物理信号(温度、pH、渗透压)完成定殖 鞭毛在 EHEC 的定殖及后续多个致病性相关过程中发挥着重要作用10,如迁徙、入侵、定殖及扩散。EHEC编码的转录激活因子 GmrA 是其进行运动和鞭毛合成所必需的,GmrA 与 fliA 基因(编码 RNA 聚合酶 sigma 因子)的启动子直接结合,调控鞭毛基因的表达。类似于正常人类肠道条件下(37,中性 pH 和生理渗透压)转录因子 GmrA 的表达量最大,调控鞭毛合成基因表达,从而配合完成EHEC 对大肠上皮细胞的定殖11。EHEC 也可以通过环境pH 来调节硝酸盐/亚硝酸盐的氧化还原过程,从而调制自身
17、对环境 pH 的适应性12。在低镁环境条件下,EHEC 利用 PhoQ/PhoP 双组分信号转导系统感知低镁信号,并直接结合 LmiA 的启动子区域,以激活 LmiA(low magnesium-induced regulator A)表达。LmiA 编码低镁诱导调节因子,对 EHEC 的毒力有正向调节作用,在低镁条件下,LmiA 可以直接结合 Ler 启动子区域,介导EHEC的LEE基因表达,从而促进EHEC的肠道定殖13。与此类似,在高磷酸盐环境下(类似人体肠道环境),PhoB/R 双组分系统被抑制,EHEC 生成小 RNA esrL 的抑制被解除,生成的小RNA EsrL通过与Ler m
18、RNA(编码LEE基因的转录因子)的 5UTR 相结合,维持其稳定性,进而介导毒力相关基因 LEE 的表达,促进 EHEC 的定殖过程14。在肠腔中由肠道菌群正常代谢产生的高浓度吲哚可以降低142 食品安全质量检测学报 第 14 卷 EHEC毒力基因LEE的表达,EHEC细胞表面的组氨酸传感器激酶 CpxA是吲哚含量感受器,EHEC通过感知吲哚含量来寻找合适的感染位点15,同时,吲哚以浓度依赖的方式影响 EHEC 毒力基因 LEE 的表达。1.4 体外的定殖研究 在自然环境中,EHEC 通常在反刍动物的粪便或屠宰不规范的牛肉中检出16,因此在监督抽检中需要对牛源性产品是否被 EHEC 污染进行
19、重点监控,如牛肉、牛乳等。在体外,EHEC 还可利用植物作为替代宿主,其在水果蔬菜等植物性食物中的残留,可能与人群中胃肠炎爆发有关17。EHEC 在植物环境中可改变其代谢能力,利用植物的营养(如碳水化合物)合成必需氨基酸17。因此,未经消毒处理的生食蔬菜、未完全熟制的牛肉制品或被污染的牛肉制品中均有可能检出 EHEC。在体外,通过器官芯片微流控培养试验发现,与小鼠肠道菌群代谢物相比,人类菌群代谢物明显增强了 EHEC 损伤人结肠上皮细胞的能力,该差异主要由 4-甲基苯甲酸、3,4-二甲基苯甲酸、己酸和庚酸这 4种人类肠道菌群代谢物介导,这些代谢物可诱导 EHEC 鞭毛蛋白的表达,促进致病性,部
20、分介导了人类对 EHEC 的高易感性,而在老鼠体内,因为肠道菌群的差异而无此现象,因此,人类比老鼠更易感染 EHEC18。2 EHEC 黏附 定殖是 EHEC 在整个肠道迷宫中选择大肠上皮细胞作为入侵位点的过程,随后 EHEC 将和大肠上皮细胞紧密接触完成黏附。这一过程受到多种细胞因子的协同调控,EHEC 主要是通过群体感知效应完成对大肠上皮细胞的黏附19。EHEC 可以产生并感应自动诱导子(autoinducers,AI),当 AI 到达一定的阈值,即达到一定的细胞密度,细菌通过检测到的 AI 信号值调节改变基因的表达。有趣的是,AI是一种肾上腺素和去甲肾上腺素的类似物,EHEC 不仅应答
21、AI,而且应答肾上腺素和去甲肾上腺素20。在黏附过程中,碳源对于 EHEC 毒力基因的表达调控也有重要的影响,EHEC通过双组分信号转导系统 FusK/R(FusK 是一种膜结合组氨酸传感器激酶,FusR 是一种应答调节器)能够感知岩藻糖的存在,控制 LEE 基因的表达,当糖分解环境正常时,能够促进 LEE 基因的表达,相反,糖异生环境中 LEE基因的表达受到抑制21。选择合适的定殖位点后,EHEC 会形成黏附与脱落(attaching and effacing,A/E)损伤22,A/E损伤的相关基因位于染色体上称为 LEE 的区域,LEE 毒力岛区域编码型分泌系统(type secretio
22、n system,T3SS)、黏附素(intimin)蛋白 和 黏 附 素 的 受 体 蛋 白(translocated intimin receptor,Tir)23。T3SS 与细菌的鞭毛有着共同的祖先,黏附过程中EHEC 通过 T3SS 有序地将各种效应蛋白注射到宿主细胞内调节黏附过程24。A/E 损伤过程中,受体蛋白 Tir 首先易位并通过 T3SS 插入宿主的细胞膜25,随后 intimin 与 Tir的胞外域结合,产生特异性的紧密黏附,Tir 与 intimin 的结合,指导微绒毛处肌动蛋白单体的再聚合作用和其他细胞骨架成分重排为基座形成必需的结构,产生 Tir 的磷酸化作用并触发
23、大量宿主信号途径26。在 EHEC 感染的线虫模型中,EHEC 可以诱导微绒毛特异性肌动蛋白5(actin-5,ACT-5)的错误定位及微绒毛脱落,在这个过程中,有丝分裂细胞周期蛋白 B3(cyclin B-3,CYB-3)结合并激活宿主细胞周期依赖激酶 1(cyclin-dependent kinase 1,CDK1)来调控有丝分裂细胞周期,CYB-3 及 CDK1 活性对于 EHEC 诱导的 ACT-5错误定位是必需的,最终形成CYB3/CDK-1到下游CYK-1、profilin-1(PFN-1)及 RfaD 的信号通路,导致细胞骨架重排及微绒毛消失27。EHEC 导致的腹泻是离子从宿主
24、细胞中分泌的结果,微绒毛的消失使离子吸收下降,从而导致腹泻症状的加重。EHEC 黏附和脱落损伤如图 1 所示28。在EHEC致病过程中,T3SS分泌的效应蛋白发挥了关键的作用。这些效应蛋白的作用包括:(1)细胞骨架重塑,形成紧密黏附和基座,调控 Rho GTPases 活性29;(2)操控宿主免疫反应,抑制吞噬作用,破坏宿主先天免疫3031;(3)调控细胞的生存/死亡,延长细胞周期,操控宿主细胞死亡3234;(4)破坏肠道完整性,微绒毛脱落同时保持对宿主细胞的黏附,转变肠道细胞中离子和水的转运,破坏细胞之间的紧密连接35;(5)操控宿主细胞内的 NF-B和 MAPK信号通路3637。EHEC
25、感染中,少量病原菌定殖即可影响肠道稳态,其感染剂量为 10100 CFU38。在利用鼠柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium,CR)感染小鼠模拟人类感染 EHEC过程中39,感染前 3 d CR 仅存在于盲肠中,第 4 d 定殖于结肠,宿主细胞周期和DNA修复过程显著上调,三羧酸循环和氧化磷酸化代谢途径下调;感染早期杯状细胞和深隐窝分泌细胞显著减少,肠道上皮细胞内胆固醇平衡异常,胆固醇合成、内吞及外排同时上调,表明少量病原菌定殖即可导致肠道上皮细胞及肠道菌群快速重编程。3 志贺毒素 EHEC 的致病性主要体现在黏附和志贺毒素(Shiga toxin,Stx)两个方面。志贺毒素由
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