金属纳米团簇荧光探针联合新...在核酸检测领域中的应用现状_梁春贤.pdf
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1、综 述基金项目:广西高校中青年教师科研基础能力提升项目(),广西壮族自治区卫生健康委员会自筹经费科研课题()第一作者简介:梁春贤,本科,教授,研究方向:药学及医药营销。通信作者简介:邹联佳,本科,讲师,研究方向:医学检验。通信作者简介:林夏,硕士,副教授,研究方向:小分子荧光探针。金属纳米团簇荧光探针联合新型纳米材料在核酸检测领域中的应用现状梁春贤 邹联佳 林 夏 赵斌斌(广西卫生职业技术学院 药学院,医学技术学院,广西南宁市)【提要】核酸检测技术在临床诊断、基因治疗和生物医学发展中发挥着重要的作用。金属纳米团簇()荧光探针是一种具有极大应用潜力的荧光探针,最常用的有银纳米团簇()荧光探针和铜
2、纳米团簇()荧光探针,可用于检测 和。新型纳米材料,如氧化石墨烯、纳米碳氧化物、金纳米颗粒、二硫化钨纳米片能够猝灭多种荧光团的荧光信号。利用新型纳米材料对单链 和双链 的吸附能力具有巨大差异的特性,可设计出“”型检测平台。此外,将新型纳米材料如二氧化硅纳米颗粒、磁性微球等,与 荧光探针联用时,可获得荧光放大效应。本文总结了近年来在核酸检测方面 荧光探针与纳米材料联用的各种检测平台,分析这些 荧光探针检测平台的设计原理、荧光行为及检测能力等,为疾病诊断和病理研究的分子工具提供参考。【关键词】金属纳米团簇;荧光探针;新型纳米材料;核酸检测;检测平台;荧光放大效果;综述【中图分类号】【文献标识码】【
3、文章编号】():核酸检测在临床诊断、基因治疗和生物医学发展中发挥着重要的作用。识别并定量与某些疾病相关的特定 序列,是核酸检测的核心目标。实时荧光定量、测序和 微阵列技术已被广泛用于核酸检测领域。此外,一些成本更低、操作更简便的技术,如荧光法、电化学法和化学发光法,也已逐步开发。在上述的方法中,荧光法具有安全、简便和灵敏的优势,主要是依靠荧光探针来获得有效的信号转导。传统的荧光探针包括分子信标、有机染料、量子点等,存在与靶标结合的亲和力和特异性不高、毒性较大等缺点。金属纳米团簇(,)荧光探针则能解决上述难题。是一类新兴的荧光纳米材料,具有优良的生物相容性和光稳定性、亚纳米尺寸、易于合成等特点。
4、的制备主要是基于模板法,合成模板包括树枝状大分子、聚合物、蛋白质和,其中采用 作为合成模板的研究最多。以 为模板合成的 具有高度的模板依赖性,通过调整碱基序列、链长度、二级结构,可以制备具有不同荧光光谱性质、不同荧光强度的。通常由数个至数十个原子组成,直径通常小于 ,介于金属原子(独特的光学性质)和纳米颗粒(等离子体)之间,具有类似分子的性质,如最高占据分子轨道和最低未占分子轨道的相互转变、可调的发光、大斯托克斯位移、量子化电荷、分子手性和磁性等。较小的体积使其具有可离散的能级,其性质不符合等离子体,也不具备导电性,但 与光的相互作用仍然存在,使其在特定条件下可以发射荧光。还具有良好的水溶性和
5、分散性,以及较高的荧光量子产率,且制备方法简便快速,因此在分析传感领域得到了广泛的关注,如金属离子、无机离子、生物小分子、蛋白质、核酸物质 的检测,生物标记成像 等领域。目前,常见的 荧光探针有银纳米团簇(,)荧光探针、铜纳米团簇(,)荧光探针、铜纳米颗粒(,)荧光探针等。需要说明的是,由于铜对氧气较为敏感,想要制备出直径小于 的 具有一定难度,因此在某些情况下会制备成粒径稍大的 荧光探针,后者同样也具有荧光效应。,新型纳米材料具有独特的尺寸、形状和光电特性,以及良好的生物相容性、药物控制释放性,且易于合成和改性,与 荧光探针联用,可克服荧光背景干扰,或者获得荧光放大效应。例如,氧化石墨烯、纳
6、米碳氧化物、金纳米颗粒(,)、二硫化钨纳米片能够猝灭多种荧光团的荧光信号,与 荧光探针联合应用可设计出“”型检测平台,有利于消除荧光背景干扰;二氧化硅纳米颗粒与 荧光探针联用时可放大荧光偏振效应;磁性微球与 荧光探针联合应用则可起到荧光富集作用。本文总结了近年来 荧光探针与新型纳米材料联用所搭建的检测平台在核酸检测方面的研究进展,分析这些 荧光探针检测平台的设计原理、荧光行为及检测能力等,为疾病诊断和病理研究的分子工具提供参考。荧光探针与新型纳米材料联用的“”型检测平台 近年来,高选择性和高灵敏性的荧光检测平台受到研究者们的青睐,其检测原理是在检测平台中添加靶标物后荧光强度发生明显变化。广义上
7、而言,荧光强度由无(弱)到有(强),可称之为“”型检测平台;荧光强度由有(强)到无(弱),则称之为“”型检测平台。而本文所述的“”型检测平台不但含有荧光探针,还含有荧光猝灭剂,荧光探针未与靶标物结合之前,荧光探针的荧光发射团被荧光猝灭剂束缚,整个体系处于弱荧光或无荧光状态,即荧光猝灭状态;当荧光探针与靶标物结合后,荧光探针可以挣脱荧光猝灭剂的束缚,荧光团的发射功能得以恢复,整个体系的荧光显著增强,实现“”效应。因生物样品较复杂,样品中可能含有自带荧光的物质(如荧光蛋白等),荧光猝灭剂可以消除这种样品自身所带的荧光,从而消除检测过程中的背景干扰。因此,在生物样品检测领域,“”型检测平台比“”型检
8、测平台更有优势。目前,除核酸检测外,“”型荧光检测方法已成功应用于凝血酶、肝素、神经节苷脂、抗坏血酸等生物样品的检测。氧化石墨烯与 荧光探针联合应用 石墨烯由扁平单层碳原子紧密堆积而成,具有二维平面蜂窝状结构,它的特异性表面积大、导热性好、电迁移率高、生物相容性高、化学稳定性高,且生产成本低,在材料科学和生物医学领域已有了广泛应用。但石墨烯的水溶性差,为解决这个问题,可将亲水性官能团(如羧基,羟基等)添加至石墨烯二维平面结构上,制成氧化石墨烯以增加亲水性。但制备氧化石墨烯需要经过“氧化剥离纯化”等过程,制备过程比较复杂。此外,不同的制备方法、实验条件的差异及不同的石墨来源均会对氧化石墨烯的结构
9、产生一定的影响,导致无法确定氧化石墨烯的精确结构,从而使获得质量均一的氧化石墨烯材料成为一个难题。氧化石墨烯对单链 吸附能力强,对双链吸附能力弱。当 荧光探针中的单链(模版)与氧化石墨烯联用时,会通过 堆积作用吸附于氧化石墨烯表面,氧化石墨烯的快速电子转移和底物吸附能力会导致 荧光探针的荧光信号猝灭。当靶标物 与氧化石墨烯上的单链 杂交互补形成双链后,荧光探针会挣脱氧化石墨烯的束缚,使荧光得到恢复。等通过这种方式达到在数分钟内同一溶液中同步检测多种目标 的目的,检测下限低至 ,但该技术尚未应用至实际样品。等在同一个氧化石墨烯平台上,联用 种不同发射波长(、)的 荧光探针构建了“”型检测平台,其
10、可同时检测 种。随后,等对其中的一个探针()进行了进一步研究,获得的线性范围是 。另外,该平台对单碱基错配序列具有良好的识别能力,对单碱基错配靶标、双碱基错配靶标、非互补靶标 的信号强度分别为 、,通过荧光信号的强弱可以判断发生错配的碱基数量,荧光越弱,错配的碱基越多。等在氧化石墨烯上联合红外()和近红外()发光的 种 荧光探针搭建了“”型检测平台,可分别检测 和 基因,检 测 下 限 分 别 是 和 。等在氧化石墨烯的基础上引入了杂交链式反应(,),见图,即将 条互补的 设计成 个发夹型 荧光探针(和),个探针吸附在氧化石墨烯上,荧光信号弱;当加入靶标 后,靶标 先与 的部分片段杂交,剩余的
11、未杂交片段再与 的杂交,促发 而形成 和 长链复合物,使探针的荧光信号得以恢复且不断累积。该方法的检测下限为 。广西医学 年 月第 卷第 期图 荧光探针与纳米材料联合搭建“”型检测平台,注:为 荧光探针与氧化石墨烯联合促发的;为 荧光探针与纳米碳氧化物联合用于 检测;为 荧光探针与 联合用于 检测。为靶标,为纳米碳氧化物,为荧光共振能量转移,为添加盐溶液,为无荧光的 荧光探针,为作为间隔段的 片段,为发荧光的 荧光探针。纳米碳氧化物与 荧光探针联合应用 纳米碳氧化物是一种能量受体,对荧光探针呈现出类似于氧化石墨烯的荧光猝灭效果,其具有更宽的光吸收窗,制备方法简单、经济,应用于基于荧光共振能量转
12、移机制的检测平台,是很有潜力的荧光猝灭剂。等利用这一纳米材料,设计了一个采用双 荧光探针的“夹心模式”检测平台。如图,在靶标 存在时,体系中可形成“双荧光头”的双链 杂交体,解除了纳米碳氧化物对单链 荧光探针的吸附,并且以浓度依赖的方式恢复荧光。这种双荧光发射的设计,有利于提高检测灵敏度。该方法的线性范围是 ,检测下限低至 。与 荧光探针联合应用 同样对荧光探针具有超高的荧光猝灭能力,与上述两种纳米材料类似,灵活的单链 很容易被吸附在未经修饰的 胶体上。通常情况下,一定浓度的盐会诱导 聚集,从而使 丧失它的“荧光猝灭剂”特性。由于吸附了单链 的 (即结合体)之间存在很强的静电排斥作用,因此可以
13、防止 聚集,从而保留 的“荧光猝灭剂”特性。而双链 因刚性较大,无法吸附在 上,不能阻止 之间的聚集,而聚集后的 则丧失了荧光猝灭的能力。基于此,等开发了一种无标记式的 特异性序列检测平台。该检测平台利用了分散的 能猝灭 荧光探针荧光的这一特性。而这种荧光猝灭效果是基于表面等离子体增强能量转移这一过程实现的。其对 荧光探针的 模板进行了设计,该 片段的两个末端都是“发射体核”形成序列,中间编码一段单链 作为间隔,这段间隔 可以被吸附到分散的 表面,从而使探针发生荧光猝灭。对于两端的发射体核 序列(形成 荧光探针的 模板)而言,不同的模板序列所形成的探针,它们的荧光强度是不一样的,通过合理的设计
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