基于表面增强拉曼光谱技术的肿瘤标志物检测进展_黄笑天.pdf
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1、基于表面增强拉曼光谱技术的肿瘤标志物检测进展黄笑天,李斌,莫天录*,刘箐*,于影,吴娅芳,王英林,姜嘉烨上海理工大学健康科学与工程学院,上海 200093*联系人,E-mail:;2022-10-24 收稿,2022-12-24 修回,2022-12-26 接受,2023-01-03 网络版发表上海市医工交叉项目、上海市军民融合项目和青年教师培养资助计划(10-22-308-803)资助摘要肿瘤标志物是反映肿瘤发生情况的物质,与肿瘤诊断、治疗与监测息息相关,肿瘤标志物检测是肿瘤早期筛查的有效手段.随着精准医疗时代来临,对肿瘤标志物检测技术的要求不断提高,表面增强拉曼光谱(surface-en-
2、hanced Raman spectroscopy,SERS)技术利用纳米粒子间的局域表面等离激元共振效应,增强分子光谱信号,提高检测灵敏度和准确度,成为了肿瘤标志物检测技术研究的热点,在生物医学、临床诊断等领域具有极大发展潜力.本文以组织检测和液体活检为分类,综述了近5年基于SERS肿瘤标志物检测的研究进展,并提出了通过样品处理、基底改进和探针制备等方式提升标志物检测灵敏度、特异性的思路.同时,本文对SERS技术在临床应用中面临的挑战和发展进行了分析与展望,以期开发出更具潜力的检测技术.关键词肿瘤标志物,表面增强拉曼光谱技术,肿瘤诊断,液体活检,生物医学肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病,世界
3、范围内恶性肿瘤的发病率仍在逐年上升1.肿瘤标志物是特征性存在于恶性肿瘤细胞,或由其异常产生的物质,一般存在组织、血清及其他体液中,反映肿瘤的发生和发展情况,也可用于监测肿瘤治疗效果.肿瘤标志物检测是肿瘤早期筛查及诊断的有效手段,肿瘤的早筛早诊为患者争取治疗时间,是肿瘤防治的关键.传统肿瘤标志物检测有酶联免疫吸附测定(enzyme linked im-munosorbent assay,ELISA)、放射免疫分析(radioimmu-noassay,RIA)、质谱分析2和免疫组化3等方法,但这些方法存在灵敏度低、操作繁琐等问题,不利于肿瘤早期低浓度标志物的筛查,因此开发一种便捷、灵敏且准确度高的
4、肿瘤标志物检测手段具有重要意义.拉曼散射是入射光在材料表面产生的非弹性散射,拉曼光谱技术是由于拉曼散射使样品产生分子振动的技术4,可提供样品分子独特的光谱特征.然而拉曼光谱的信号较弱,并未广泛应用于检测中.表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS)技术是利用纳米间隙之间的局域表面等离激元共振(loca-lized surface plasmon resonance,LSPR)增强分子拉曼信号的检测技术.贵金属纳米粒子间隙因光电场的作用产生高强度局域电场(即“热点”),当分子处于“热点”中,会产生很强的拉曼散射5.SERS技术即将样品吸附
5、在金属纳米粒子上,利用“热点”实现高灵敏检测.除了提升灵敏度外,SERS检测还能避免样品中水的干扰(水本身的拉曼散射很弱)6,同时检测多个生物标志物(可从样品上的多个位置收集光谱信息)4,是开发肿瘤标志物检测技术的有力工具7.对SERS检测技术的研究通常包括样本处理、基底改进以及探针制备.此外,SERS检测通常与基于机器学习的智能分析平台结合8,对已知样本数据进行建模与分析,准确预测未知样本,最终实现肿瘤标志物检测.本文以基于SERS的引用格式:黄笑天,李斌,莫天录,等.基于表面增强拉曼光谱技术的肿瘤标志物检测进展.科学通报,2023,68:17871798Huang X T,Li B,Mo
6、T L,et al.Advances in tumor marker detection using surface-enhanced Raman spectroscopy(in Chinese).Chin Sci Bull,2023,68:17871798,doi:10.1360/TB-2022-1063 2023中国科学杂志社2023 年第 68 卷第 14 期:1787 1798评 述肿瘤标志物检测为例,从以上方面进行讨论,为检测传感器的研究提供一些通用的思路.1组织中肿瘤标志物的SERS检测组织肿瘤标志物检测是肿瘤诊断的传统方法,研究人员将SERS技术与肿瘤组织检测相结合,用于肿瘤标志
7、物的高灵敏度检测.对于标志物的检测研究通常起步于单细胞系,然而由于细胞分化,组织与单细胞系的成分明显不同,目前SERS已达到了组织样品检测的水平,并且开发了多种针对肿瘤组织的SERS高灵敏检测平台.如何避免由于灵敏度增强,导致样品环境影响增大的问题,是研究者在组织检测方面考虑的重点.Zhang等人9基于SERS技术对正常肝和肝癌组织切片进行研究,获得了肝组织的成分变化信息.同时,通过主成分分析(principal component analysis,PCA)和线性判别分析(linear discriminate analysis,LDA)处理数据,验证了SERS对癌变肝组织和正常肝组织的分辨
8、能力,并建立了肝组织的SERS数据集,细化了正常肝组织与肝癌组织在分子水平上差异.Czaplicka等人10对组织处理方法进行改善,利用SERS技术成功识别出唾液腺肿瘤.组织匀浆是样本制备最常用的方法,通过裂解细胞以释放胞内标志物.此研究通过温度调控、酶催化以及超声处理来优化组织样品制备方法,使SERS图像的强度和分辨率明显增加.同时通过PCA、主成分回归(principal component regression,PCR)多变量校准分析和偏最小二乘判别分析(the partial least squares dis-criminant analysis,PLSDA)处理光谱数据,成功区分出
9、健康和肿瘤组织,如图1(a)所示.Shen等人11将流式细胞术与SERS结合,从乳腺组织样本中分离出乳腺癌单细胞,避免了脂肪细胞对检测的干扰.经过对SERS信号的分析,成功区分了乳腺癌单细胞和正常上皮单细胞.Mert等人12开发了一种简单快速的样品制备方法,用于诊断甲状腺肿瘤.在载玻片上制备聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)层,以消除玻璃的背景信号,并在冷冻组织切片中加入银纳米颗粒(silver na-noparticles,AgNPs)胶体悬液,放在载玻片上进行扫描,如图1(b)所示,预测恶性、良性和健康组织的准确度达到100%.除区分正常组织与肿瘤组织外,
10、SERS技术还可帮助预测潜在的肿瘤标志物.Honda等人13使用金纳米颗粒(gold-nanoparticle,AuN)作为SERS基底,通过检测来自Au的散射光来可视化含硫代谢物,并判断出480 cm1处SERS信号较高者(表明多硫化物存在)可作为透明细胞癌(clear cell carcinoma,CCC)患者总生存期的预测指标.2体液中传统肿瘤标志物的SERS检测除组织检测外,针对肿瘤标志物的体液检测也是一种重要的肿瘤诊断方式.其主要通过检测体液中的某些物质及浓度,从而判断患者的患病情况.区别于新型液体活检技术对DNA、游离肿瘤细胞的检测,传统体液检测的对象为体液中的蛋白质、代谢物14等
11、.除建立SERS与机器学习结合的肿瘤标志物诊断平台外,图 1(网络版彩色)SERS检测在组织肿瘤标志物中的应用.(a)PCA用于分析唾液腺匀浆SERS的差异10;(b)PDMS涂层载玻片在SERS中应用及PCA-LDA分析12Figure 1(Color online)Application of SERS detection in tissue tumor markers.(a)PCA was used to analyze differences in SERS of salivary glandhomogenates10;(b)application of PDMS coated sli
12、des in SERS and PCA-LDA analysis122023 年 5 月第 68 卷第 14 期1788研究者同时对样品处理、基底及探针制备进行研究,以进一步提升SERS检测的灵敏度与准确度.体液中肿瘤标志物的检测可分为直接检测和间接检测两类.直接检测时,样品与SERS基底结合后直接进行扫描,提高了检测的简便性和经济性,对癌症的早期发现具有重要的临床价值.Lei等人15以AgNPs作为底物,将SERS技术应用于肺癌的检测.研究者对肺癌患者血清和正常血清的SERS光谱,进行PLSDA分析,处理肺癌和正常血清平均光谱之间的差异,为血清样本中蛋白质的SERS分析和鉴定提供了借鉴,有望
13、应用于早期肺癌的临床诊断.Cheng等人16,17制备了纳米等离子生物传感芯片(nanoplasmonics biosensing chip,NBC),其由多个在纤维素滤纸上的Au-Ag纳米复合物修饰的氧化锌纳米棒组成.将检测结果分别用卷积神经网络(convolutional neural network,CNN)分类器、深度神经网络(deep neural network,DNN)建模,构建了2种直接血清学检测平台,可在几分钟内自动识别肝癌样本,适用于临床所需的即时检验(point-of-caretesting,POCT).代谢产物由于尺寸比纳米粒子小得多,难与基底靶向结合,常采取直接方式进
14、行检测14.Xiao等人18将Au-Ag复合纳米棒与血清直接混合,首次对肝癌患者血清代谢物进行SERS检测,同时比较了3种癌症的血清SERS,以确定癌症患者的一般血清代谢变化,最后采用正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis,OPLS-DA)评估诊断准确性.结果表明,与乳腺癌和肺癌样本相比,肝癌样本中发现了色氨酸(tryptophan,Trp)、苯丙氨酸(phenyla-lanine,Phe)等标志代谢物,且癌症组中存在共同的代谢产物脯氨酸(proline,Pro)、缬氨酸(valine,Val)等
15、,显示了基于SERS的代谢物检测在肿瘤诊断中广阔的应用前景.在直接检测时,除了利用底物热点增强信号,研究者也常通过简单样品处理来提升检测的灵敏度.咖啡环效应是指在液滴溶剂挥发时,大多数纳米颗粒在外围沉积形成环的现象19.Gao等人20将银纳米颗粒分别与患者和健康者的血清混合并干燥,在外围形成咖啡环,环区聚集的金属纳米颗粒形成了许多“热点”,从而极大地增强了拉曼信号.通过偏最小二乘(partial least square,PLS)和支持向量机算法(supportvector machine,SVM)进行了分析,建立了SERS光谱数据分类诊断模型,如图2(a)所示,该方法同时识别正常组和肝癌、前
16、列腺癌样本的准确率达到98.04%.Lin等人21利用羟基磷灰石颗粒(hydroxyapatite particles,HAp)特异性吸附能力从血清中靶向吸附白蛋白,随后采用蛋白释放试剂PO43溶液从HAp表面分离白蛋白,在不损伤白蛋白结构的情况下提高样品浓度,从而增强了样品的SERS信号,同时将PLS和LDA结合分析数据,成功区分了乳腺癌样本和健康样本.Lin等人22以AgNPs为基底,利用醋酸纤维素膜(cellulose acetatemembrane,CA)取代传统电泳法分离底物,简便快速地从血清中提取血清蛋白,并通过PLS-SVM多变量分析算法区分乳腺癌患者与正常患者血清蛋白SERS信
17、号差异,达到了94.67%的诊断准确率.Phyo等人23开发了一种基于SERS的尿液代谢物分析系统,将银纳米线(silver nanowires,AgNWs)三维立体堆叠在玻璃纤维滤光片上,应用于胰腺癌和前列腺癌的诊断.尿样通过离心处理后加入钙离子(Ca2+),以改善代谢物与AgNWs的结合.用PCA和OPLS-DA对SERS谱进行多变量分析,结果显示了胰腺癌组与前列腺癌组之间以及正常对照组与联合癌组之间良好的区分性.间接检测通常制备SERS标签,以实现弱拉曼信号或低浓度肿瘤标志物的检测.SERS标签由拉曼报告分子(Raman reporter,RR)、核酸适配体24、抗体25等标记纳米颗粒制
18、备.开发具有高灵敏度、高特异性和高选择性的SERS标签是间接检测的关键26.RR一般具有较高的拉曼横截面,能够产生强烈的信号响应27,常用5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸)(5,5-dithiobis-(2-nitroben-zoic acid),DTNB)、4-巯基苯甲酸(4-mercaptobenzoicacid,4-MBA)、对-氨基苯硫酚(p-aminothiophenol,pATP)等.核酸适配体、抗体等生物元件用于特异性和选择性识别目标分子,人血清中谷胱甘肽(glutathione,GSH)的拉曼散射截面较小,拉曼响应较低,难以直接进行SERS检测.Li等人28将DTNB标记于金纳米
19、膜制备拉曼探针,以实现GSH的检测.基于DTNB与GSH之间的二硫键-硫键交换反应,DTNB的二硫键断裂,成为TNB分子.在中性或碱性环境中,TNB会被水解成阴离子,通过静电相互作用结合至带正电的金纳米膜表面,产生增强SERS信号,该SERS传感器的检出限为5108mol/L.-谷氨酰转肽酶(-glutamyl transpepti-dase,GGT)是与肝癌相关的标志物,Jiang等人29制备出谷氨酰胺基团探针,GGT可催化探针的-谷氨酰基键裂解,产生新物质使SERS信号发生显著变化,可在0.2200 U/L浓度范围内定量检测GGT,检测限达到0.09 U/L.该研究检测结果与ELISA一致
20、,且SERS系统操作简便,不易受酶活性的影响,显示了SERS检测在评 述1789临床应用中的可行性.黑色素瘤细胞黏附分子(MUC-18)是一种糖蛋白表面受体,可调控许多上皮性癌症如黑色素瘤的发展.Farahavar等人30将脂质体涂层的金纳米笼(Au nanocages,AuNCs)用4-MBA与MUC-18单链抗体(single-chain antibody,scFv)修饰,作为SERS标签,如图2(b)所示.脂质体层用于防止RR流出并促进标签的生物相容性,而scFv可特异性结合靶标,同时具有更强的肿瘤穿透性,实现了表达MUC18的黑色素瘤癌细胞(A375)的SERS成像,对黑色素瘤的非侵入
21、性诊断具有极大的应用价值.基底作为SERS传感器的重要组成部分,其本身材料、大小和形状也影响着SERS信号.如银纳米粒子具有更强的LSPR性能,而金纳米粒子的化学稳定性更好,因此制备的Ag-Au复合基底具有更好的适用性.作为新开发的SERS基底,半导体纳米材料兼具低成本和高稳定性的优点.此外,纳米星和纳米海胆有大量尖锐的尖峰和凹陷来产生信号增强的“热点”.夹心结构以及“核-壳”纳米结构31可用来复合多种材料性能,制备优化和增强的SERS基底,如在Au纳米颗粒的表面制备薄SiO2层,可减少样品中杂质的吸附.Tatar等人32分别制备了金纳米海胆(gold nanourchin,GNU)和金纳米球
22、(goldnanosphere,GNS),并设计GNU-GNU及GNU-GNS两种夹心传感器,用于检测癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEA-CAM5),如图2(c),结果表明,双海胆夹心结构可产生更强的电场,是用于SERS检测最有前景的结构.Zhu等人33设计了一种可产生大量热点的蜂窝结构SERS芯片,用于肝细胞癌标志物甲胎蛋白(AFP)和甲胎蛋白异质体(AFP-L3)的检测,检测范围为0.0033 ng/mL,并能准确测定AFP-L3的比例,在肝癌的临床诊断中显示出巨大的应用潜力.Gao等人34开发了一种基于SERS的双平行通道液滴微流控装置,实现了游离前列腺特异性抗原(f-PSA)和总前列腺
23、特异性抗原(t-PSA)标志物的同时检测.检测时,在通道3个入口分别加入样本、捕获抗体标记的磁珠和检测抗体标记的SERS标签,通过弯曲通道在每个液滴中快速形成磁性夹心复合物,并利用装置中的磁棒将复合物分离图 2(网络版彩色)SERS检测在体液肿瘤标志物中的应用.(a)基于咖啡环效应的血清SERS检测示意图20;(b)金纳米笼与抗体探针制备示意图30;(c)夹心型海胆SERS免疫纳米传感器检测过程示意图32Figure 2(Color online)Application of SERS detection in body fluid tumor markers.(a)Schematic dia
24、gram of serum SERS detection based on coffeering effect20;(b)schematic diagram of gold nanocages and antibody probespreparation30;(c)schematic diagram of sandwich type sea urchin SERSimmune nanosensor detection process322023 年 5 月第 68 卷第 14 期1790出来.最后测量液滴的SERS信号,以进行f-PSA和t-PSA的定量分析.检测耗时小于10 min,且检测限
25、小于0.1 ng/mL,远低于前列腺癌的临床诊断阈值,是前列腺癌准确筛查的一种有前景的临床工具.Hu等人35构造了一种基于C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)适配体的夹心探针.为防止脱落,将拉曼报告分子4-ATP封装在核-壳金纳米粒子(Au nano-bridged nanogaps parti-cles,AuNNPs)间隙中作为标签,Ag包裹Fe3O4(Ag-coated Fe3O4-AuNPs,AgMNPs)用于磁分离和浓缩CRP分子,标签上修饰CRP适配体进行特异性识别,用于AuNNPs-CRP-AgMNPs夹心构造以及增强SERS信号,检测限为1014mol/L,
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