低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织...、细胞凋亡和组织结构的影响_李豫.pdf
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1、DOI:10.12131/20220227文章编号:2095 0780(2023)03 0068 10低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织抗氧化能力、细胞凋亡和组织结构的影响李 豫1,黄建盛1,陈有铭2,温震威1,欧光海1,黄鉴鹏1,蒋鑫涛1,谢瑞涛3,马 骞1,陈 刚1,41.广东海洋大学 水产学院,广东 湛江 5240882.广东蓝粮种业有限公司,广东 湛江 5242563.广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室,广东 湛江 5240884.广东恒兴饲料实业股份有限公司,广东 湛江 524094摘要:军曹鱼(Rachycentron canadum)鳃组织对水温变化敏感。为探究低温胁迫对军曹鱼幼
2、鱼鳃组织的影响,揭示该鱼应对低温胁迫的响应机制,实验设置2个低温胁迫组(18、21)和1个对照组(28),比较分析鳃组织在胁迫后第0、第4和第7天的氧化应激状态、细胞凋亡和组织结构情况。结果显示,低温胁迫下鳃组织超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著低于对照组(P0.05),丙二醛(MDA)浓度显著高于对照组(P0.05);低温胁迫组鳃组织凋亡相关基因bax、caspase-9、caspase-3、p53和mdm2表达量在第4和第7天时相较于对照组显著升高(P0.05),bcl-2基因表达量显著降低(P0.05);TUNEL检测显示低温组鳃组
3、织细胞凋亡率升高;组织学分析表明低温胁迫下鳃组织出现了不同程度的鳃小片排列紊乱、基部增生、融合,上皮细胞和泌氯细胞空泡化等现象。研究表明,低温胁迫抑制了军曹鱼幼鱼的鳃组织抗氧化酶活性,造成氧化损伤,进一步诱导细胞凋亡,破坏鳃组织结构完整性。关键词:军曹鱼;低温胁迫;鳃;氧化应激;细胞凋亡;组织结构中图分类号:Q 178;S 965.399文献标志码:A 开放科学(资源服务)标识码(OSID):Effect of low temperature stress on antioxidant stress,apoptosis andhistological structure of gills in
4、 cobia(Rachycentron canadum)LI Yu1,HUANG Jiansheng1,CHEN Youming2,WEN Zhenwei1,OU Guanghai1,HUANG Jianpeng1,JIANG Xintao1,XIE Ruitao3,MA Qian1,CHEN Gang1,41.College of Fisheries,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China2.Guangdong Blue Granary Seed Industry Co.,Ltd.,Zhanjiang 524256,China3.G
5、uangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture,Zhanjiang 524088,China4.Guangdong Evergreen Feed Industry Co.Ltd.,Zhanjiang 524094,ChinaAbstract:The gill tissue of cobia(Rachycentron canadum)is sensitive to water temperature changes.In order to investigate th
6、eeffect of low temperature stress on juvenile cobia,and reveal its response mechanism to low temperature stress,we designed two第 19 卷第 3 期南 方 水 产 科 学Vol.19,No.32023 年 6 月South China Fisheries ScienceJun.,2023收稿日期:2022-08-24;修回日期:2022-10-15基金项目:国家重点研发计划项目(2022YFD2401203,2020YFD0900200);广东省科技计划项目(2016
7、B020201009);国家现代农业产业技术体系(CARS-47)作者简介:李豫(1998),女,硕士研究生,研究方向为鱼类生物学与遗传育种。E-mail:通信作者:马骞(1983),女,副教授,博士,研究方向为海水鱼类发育学、生理学与遗传育种。E-mail:陈刚(1961),男,教授,研究方向为鱼类种子工程与养殖。E-mail:low temperature groups(18 and 21)and one control group(28),to analyze the antioxidant responses,expression of apo-ptosis-related genes
8、 and histological structure of the gills on 0,4th and 7th day after the stress.The results show that the activi-ties of superoxide dismutase(SOD),catalase(CAT)and glutathione peroxidase(GSH-Px)in the low-temperature groups were signifi-cantly lower than those in the control group(P0.05),while the ma
9、londialdehyde(MDA)mass concentration in the low-tempera-ture groups was significantly higher than that in the control group(P0.05).The expression of apoptosis-related genes bax,cas-pase-9,caspase-3,p53 and mdm2 increased significantly in the low-temperature groups,while the expression of Bcl-2 decre
10、asedsignificantly on 4th and 7th day(P0.05).The TUNEL results reveal that low-temperature treatment increased the cell apoptosisrate of the gills,and caused lesions including fusion of secondary lamellae,necrosis of epithelial cell and hyperplasia of chloridecells.The results indicate that low-tempe
11、rature stress causes oxidative stress,induces apoptosis and damages the structural integ-rity of the gills,which suggests that normal physiological functions of juvenile cobia can be affected by low temperature signifi-cantly.Keywords:Rachycentron canadum;Low temperature stress;Gill;Antioxidant enzy
12、me;Apoptosis;Organization structure温度对于鱼类生长、发育和繁殖等生命活动产生直接影响。据报道,水温骤降导致的低温胁迫对鱼类增养殖业造成的不良影响呈加剧趋势1-3。已有研究表明,水温骤降会导致动物机体产生氧化应激反应4,鱼类可通过激活抗氧化酶活性、释放神经递质和激素等生理过程的调控,减少低温胁迫对其机体造成的氧化损伤5。鱼类含酶和非酶抗氧化防御系统在应对低温胁迫的过程中发挥着关键作用6,例如,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)作为具有抗氧化防御功能的重要酶,可有效清除活性氧(ROS),将细胞内的 ROS 浓度维持
13、在正常生理水平7。研究表明,低温胁迫下绿腹丽鱼(Etroplus suratensis)8和七彩神仙鱼(Symphysodon spp.)9通过提高SOD、CAT 和 GSH-Px 活性来激活鳃组织的抗氧化反应,降低机体损伤程度。然而,当水温降低程度超出鱼类应对能力范围时,机体内线粒体的ROS 产生和清除间的动态平衡被打破,导致ROS 水平迅速或缓慢升高10-11。ROS 过量累积导致线粒体损伤,进而诱导细胞凋亡12。细胞凋亡是细胞主动发生的程序性死亡,涉及凋亡相关基因的激活、表达和调控,维持组织结构及细胞内环境的稳定13-14。细胞凋亡机制复杂,目前已知的细胞凋亡途径主要有线粒体途径、内质网
14、途径以及死亡受体途径15。研究表明,低温胁迫下水生动物可通过线粒体途径介导细胞凋亡,其主要涉及 bcl-2 和 caspase 基因家族调控16-17。当应激超出细胞应对能力时,细胞线粒体内膜和外膜通透性发生变化,bcl-2 家族中抗凋亡基因(bcl-2、bcl-xl)和促凋亡基因(bax、bad、bid)相互作用调节细胞色素 C 从线粒体释放到细胞质18。在细胞质中,细胞色素 C 与 Apaf1 和 dATP 结合,从而激活 caspase-9,随后激活“执行者”caspase-3,诱发caspase 家族级联反应,最终导致细胞凋亡19。此外,低温环境引发的细胞和组织的生理生化反应,可能会导
15、致组织结构和功能发生变化20。据报道,鱼类处于低温环境下可能会造成鳃组织结构损伤21。例如,尼罗罗非鱼(Oreochromis niloti-cus)3、鲤(Cyprinus carpio L.)22和花鲈(Lateolab-rax maculatus)23通过鳃小片增生、肥大等,增加外界刺激与机体血液间的距离来响应低温胁迫,恶劣的低温环境会使鳃组织出现上皮破裂脱离、细胞空泡化等不可逆损伤,导致机体缺氧死亡24。军曹鱼(Rachycentron canadum)因具有饲料转化率高、生长速度极快、肉质鲜美等特点,已在中国、越南、澳大利亚和美国等多个国家开展人工养殖25-26。然而,作为一种暖水性
16、经济鱼类,军曹鱼对低温较为敏感,其适宜生长水温为 2532,水温低至 21 时摄食量明显降低,18 时静止于水底27。寒潮来临时,水温降低且通常持续时间较长,不利于军曹鱼的生长及生存,造成经济损失。目前关于低温胁迫对军曹鱼影响的研究主要集中在血清生理生化水平28、肝组织脂代谢29和氧化防御28等方面。鳃作为鱼类气体交换、渗透压调节和离子转运的重要器官,与外界环境直接接触且接触面积较大,水温变化会影响鳃组织状态23;因此与其他组织器官相比,鳃组织对于水温变动更为敏感30-32。因此,阐明低温胁迫对鳃组织的影响对于揭示军曹鱼应对低温胁迫的响应机制具有重要意义。本文通过研究军曹鱼鳃组织在低温胁迫下的
17、氧化应激指标,细胞凋亡和凋亡相关基因的表达及组织结构的变化,旨在揭示低温胁迫对其第 3 期李 豫等:低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织抗氧化能力、细胞凋亡和组织结构的影响69幼鱼鳃组织功能和结构完整性的影响,为研究军曹鱼低温适应调控机理提供基础数据。1 材料与方法 1.1 实验材料及实验设计军曹鱼幼鱼由广东海洋大学海洋生物研究基地提供,在广东恒兴饲料股份有限公司 863 基地的室内 24 h 流水养殖系统暂养 2 周。暂养期间每天8:00 和 17:00 投喂配合饲料(广东东腾饲料有限公司),养殖水体保持溶氧质量浓度 5 mgL1以上,氨氮质量浓度小于 0.02 mgL1,pH 7.68.0,温度 2
18、729、盐度 2830。暂养结束后挑选 180 尾体质健康、规格一致平均体质量(39.111.01)g,平均体长(19.710.73)cm 的军曹鱼幼鱼随机分配到 9 个水槽中,每个水槽 20 尾。实验分为 3 个温度组,分别为28 对照组及 21 和 18 低温组,每组 3 个重复。降温方式参考文献 23,33-34 并做适当调整,以6 h 1匀速降温至 23 后以 12 h1匀速降温。低温组使用冰块(将冰块置于四层虾苗袋中密封放入水槽)降温,在水槽上方覆盖塑料薄膜并在水槽周围粘贴隔热棉减少温度波动,通过散气石连续曝气使水温均衡。实验期间 24 h 连续关注水温(每 2 h 测量 1 次),
19、当水温偏离实验温度 0.5 以上时即调整冰块数量。低温组和对照组静水养殖,每日更换 50%的等温海水,除水体温度改变外,其余水质条件与暂养期间保持一致。1.2 样品采集低温组水温降至实验温度后开始计时并于第0、第 4 和第 7 天进行取样。每组随机挑选 12 尾鱼(每个水槽取 4 尾),使用 40 mgL1丁香酚快速麻醉后解剖分离鳃组织。6 尾鱼鳃组织快速放入液氮速冻,并转移至80 冰箱保存,用于酶活性和实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析。6 尾鱼鳃组织固定在 4%(体积分数)多聚甲醛(Paraformaldehyde,PFA)中,用于检测细胞凋亡和组织学染色。1.3 抗氧化指标分析C
20、AT、SOD 和 GSH-Px 活性,丙二醛(MDA)浓度均使用南京建成生物工程有限公司试剂盒测定,具体实验操作参照说明书。测定时,取鳃组织约 0.4 g,按质量体积比 19 加入预冷的生理盐水,在冰上充分匀浆后在 4 下 3000g 离心 15 min,取上清液立即用于检测。1.4 RNA 提取和定量 PCR 试验样品在液氮中研磨后,使用 TransZol Up PlusRNA Kit(北京全式金生物有限公司)试剂盒提取总RNA,1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳和 SimpliNano 超微量核酸蛋白测定仪检测其纯度和浓度。取 2 g RNA 使用 EasyScript FirstStrand
21、 cDNA Syn-thesis SuperMix(北京全式金生物有限公司)反转录试剂盒合成 cDNA。根据军曹鱼全基因组数据(NCBI BioProject ID:PRJNA634421),筛选出注释为 bax、bcl-2、cas-pase-9、caspase-3、p53、mdm2 和-actin 的基因序列信息,经 NCBI 数据库 Blast 比对验证,使用Primer Premier 6.0 设计 qRT-PCR 引物(表 1)。qRT-PCR 反应程序:94 预变性 30 s;94 5 s,58 15 s,72 10 s,40 个循环。实验结果使用2Ct法计算基因的相对表达量。1.5
22、 TUNEL 检测和组织学分析通过 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(赛维尔,中国),使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUPT 缺口末端标记(TUNEL)技术对鳃组织样本进行染色。在正置荧光显微镜(Eclipse Ci-L,Nikon,Japan)下对样本进行成像。成像完成后使用 Image-Pro Plus 6.0 软件分析,其中凋亡细胞为绿色荧表1 引物序列Table 1 Primer sequence引物Primer引物序列(53)Primer sequence(53)基因序列Accession No.caspase-9-FGTGGAGCTCCTGCTGTTCATOP546050casp
23、ase-9-RACGGGCTGGCATCCATTTTAcaspase-3-FACCAGACAGTGGACCAGATAAOP546051caspase-3-RGTGGAGAAGGCATAAAGGAAGbcl-2-FCCACCACGGCGAAGAGAAGATTOP546048bcl-2-RCTGCGGTGTCATCTCCTCCTTGp53-FGAGACCTTCAGGAAGTACCAGCOP546053p53-RTCTCCGGTTTGTCCTTGTTGGbax-FGCAGAGTGGTCGCACTGTTCTOP546049bax-RAATGCCCTCCCAGCCTCCTTmdm2-FATCCTCGCA
24、AGAGGTTGGTGOP546052mdm2-RTCCACAGAGGAAAGCGTCAC-actin-FAGGGAAATTGTGCGTGACEU266 539.1-actin-RAGGCAGCTCGTAGCTCTT70南 方 水 产 科 学第 19 卷光,正常细胞为蓝色。阳性率=阳性细胞数/总细胞数100%。鳃组织在 4%(体积分数)多聚甲醛中固定24 h 后,进行乙醇(体积分数为 50%、70%、80%、95%和 100%)逐级脱水、二甲苯透明和浸腊包埋处理。石蜡包埋后使用 Leica RM2125 手动轮转式切片机切成薄片(56 m)进行苏木精-伊红(HE)染色。切片风干后用中性树脂封片
25、,在Nikon E80i 显微镜下观察并拍照记录。1.6 数据处理实验数据采用单因素方差分析和 Duncans 法多重比较进行显著性差异分析,P0.05 表示差异显著,使用 GraphPad Prism 8 软件作图。2 结果 2.1 低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织抗氧化酶活性的影响低温胁迫对军曹鱼幼鱼鳃组织抗氧化酶活性的影响见图 1。低温组鳃组织 SOD 和 CAT 活性在第0、第 4 和第 7 天时均显著低于对照组,且酶活性最低值均在 18 组(P0.05),在第 4 和第 7 天时则显著低于对照组(P0.05,图 1-c);MDA 浓度在第 0、第 4 和第 7 天时,低温组均显著高于对照组
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