2018年广东省广州市鸡源...沙门菌耐药性及分子特征分析_朱坤鹏.pdf
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1、*耐药监测*2018 年广东省广州市鸡源和猪源鼠伤寒沙门菌耐药性及分子特征分析朱坤鹏1,向莹2,邱少富1,2,杨海燕1,杜昕颖2摘要:目的调查 2018 年广州市鸡源和猪源鼠伤寒沙门菌的耐药性及分子特征,为合理使用抗生素和耐药菌防控提供依据。方法使用 API20E 生化试验鉴定鼠伤寒沙门菌。使用 CMV3AGNF 药敏板进行药敏试验。利用 IlluminaMiseq 测序平台进行全基因组测序,分析序列类型、抗生素耐药基因和点突变,以及构建系统发育树。结果广州市鸡源(15 株)和猪源(21 株)鼠伤寒沙门菌对氨苄青霉素、萘啶酸、四环素、氯霉素和磺胺异恶唑的耐药率60.00%,多重耐药率超过 65
2、.00%,以氨苄西林-萘啶酸-四环索-氯霉素-(甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑-磺胺异恶唑)-庆大霉素耐药谱为主,且猪源菌耐药更为严重。猪源菌对 tet(B)、aph(3)-Ib 和 aph(6)-Id 的携带率高于鸡源菌(P0.05),携带更多的耐药基因(P0.05)。GyrA 点突变在鸡源菌和猪源菌的分布差异无统计学意义。系统发育及序列类型分析发现,鼠伤寒沙门菌共分为 4 个分支,鸡源菌更具遗传多态性,C4 优势分支同时包含鸡源菌和猪源菌。结论鼠伤寒沙门菌耐药普遍,猪源菌的耐药则更为严重。畜牧业应合理使用抗生素,应加强鼠伤寒沙门菌的病原监测尤其是对猪肉食品的监测,防控耐药菌的传播。关键词:鼠伤寒
3、沙门菌;鸡源;猪源;耐药率;耐药基因中图分类号:R211;R378文献标志码:A文章编号:10039961(2023)05056707AntibioticresistanceandmolecularcharacteristicsofSalmonellaTyphimuriumisolatedfromchickenandporkinGuangzhou,Guangdongprovincein2018Zhu Kunpeng1,Xiang Ying2,Qiu Shaofu1,2,Yang Haiyan1,Du Xinying2.1.School ofPublic Health,Zhengzhou Uni
4、versity,Zhengzhou 450001,Henan,China;2.The Centre of Disease Control and Prevention ofChinese Peoples Liberation Army,Beijing 100071,ChinaCorresponding authorsCorresponding authors:Yang Haiyan,Email:;Du Xinying,Email:Abstract:ObjectiveToinvestigatetheantibioticresistanceandmolecularcharacteristicsof
5、SalmonellaTyphimuriumisolatedfromchickenandporkinGuangzhou,2018,andprovidedatasupportfortherationaluseofantibioticsandthepreventionofdrug-resistantpathogens.MethodsTheS.TyphimuriumisolateswereidentifiedbyusingAPI20Ebiochemicaltests,andantibioticsusceptibilitytestingwasperformedbyusingSensititreCMV3A
6、GNFplates.ThewholegenomewassequencedbyusingIlluminaMiseqplatformtoanalyzesequencetypes(ST),antibioticresistancegenes(ARGs)andpointmutations,andtoconstructphylogenetictree.ResultsTheantibioticresistanceratesofS.Typhimuriumstrainsisolatedfromchicken(n15)andpork(n21)inGuangzhoutoampicillin,nalidixicaci
7、d,tetracycline,chloramphenicol,andsulfisoxazolewere60.00%,andthemulti-drugresistance(MDR)ratesweremorethan65.00%.Theampicillin-nalidixicacid-tetracycline-chloramphenicol-(trimethoprim/sulfamethoxazole-chloramphenicol)-gentamicinwasthepredominantantibioticresistancepattern,andthedrugresistanceofS.Typ
8、himuriumisolatedfromporkwasmoreserious.Thecarriageratesoftet(B),aph(3)-Ib,andaph(6)-Idwerehigherinporkisolatesthaninchickenisolates,andmoreARGswerefoundinporkisolates.TherewasnodifferenceinthedistributionofgyrApointmutationsbetweenisolatesfromchickenandpork.Phylogeneticanalysisandsequencetypeanalysi
9、sshowedthattheS.Typhimuriumweredividedintofourclades.Thechickenisolatesweremoregeneticallypolymorphic,andtheC4dominantcladescontainedbothisolatesfromchickenandpork.ConclusionTheantibioticresistanceofS.Typhimuriumiscommon,andtheantibioticresistanceofthepathogenfromporkismoreserious.Antibioticsshouldb
10、eusedrationallyinanimalhusbandry.ItisnecessarytofurtherstrengthentheS.Typhimuriumsurveillance,especiallyinporkfood,forthepreventionofresistantpathogens.Keywords:SalmonellaTyphimurium;Porksource;Chickensource;Antibioticresistancerate;AntibioticresistancegeneThisstudyweresupportedbytheNationalNaturalS
11、cienceFoundationofChina(No.82173580,No.82202538,No.81873968)基金项目:国家自然科学基金(No.82173580,No.82202538,No.81873968)作者单位:1.郑州大学公共卫生学院,河南郑州450001;2.解放军疾病预防控制中心,北京100071作者简介:朱坤鹏,男,河南省商丘市人,硕士研究生在读,主要从事疾病预防控制工作,Email:通信作者:杨海燕,Tel:13592602629,Email:;杜昕颖,Tel:13611082955,Email:收稿日期:20230215网络出版日期:20230414疾病监测202
12、3年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5567www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202302150043沙门菌是一种常见的人畜共患肠道致病菌,在世界范围内广泛传播,造成了严重的公共卫生问题。目前,已鉴定出 2600 余种沙门血清型,其中鼠伤寒沙门菌是最常见的血清型之一1。在美国、加拿大、澳大利亚和新西兰,鼠伤寒沙门菌是广泛传播的血清型2。而在我国,鼠伤寒沙门菌也是最主要的血清型34。自 20 世纪 90 年代首次观察到一种流行多重耐药鼠伤寒沙门菌 DT104 克隆以来,多重耐药鼠伤寒沙门菌的传播已成
13、为一个严重的全球性问题5。近年来,鼠伤寒沙门菌 ACSSuT(氨苄西林、氯霉素、链霉素、磺胺类和四环素)耐药模式比例也较高6。为预防、治疗疾病和控制以及促生长或提高饲料效率,畜牧业广泛使用抗菌素,导致鼠伤寒沙门菌耐药性增强,耐药菌株的传播,已严重威胁公众健康67。目前,沙门菌流行病学研究中使用全基因组测序技术变得越来越普遍,可以实现精确的序列类型和耐药相关的基因或点突变检测等分子层面研究89。广东省动物源性沙门菌感染情况十分严重。一项研究报道,广东省鸡源沙门菌携带率高达63.58%(302/475),猪源高达 74.30%(318/428)10。广东省是中国重要的畜牧生产区,也是动物性食品消费
14、大省,然而对动物源尤其是鸡源与猪源鼠伤寒沙门菌耐药性及分子特征的研究鲜有报道。本研究以 2018 年广州市鸡源和猪源鼠伤寒沙门菌为研究对象,旨在了解其耐药性及分子特征,为抗生素在畜牧业的合理使用与鼠伤寒沙门菌的病原监测提供科学依据。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株来源基于本实验室分离鉴定并保存的2018 年广州市 36 株鼠伤寒沙门菌,其中鸡肉样品分离 15 株,猪肉样品分离 21 株。1.1.2主要试剂志贺菌沙门菌(SS)琼脂培养基(北京路桥技术股份有限公司)、API20E 试剂条(法国生物梅里埃公司)、血清分型试剂(日本生研公司)、CMV3AGNF 药敏板(美国赛默飞世尔科技公司)、Q
15、IAampDNAMinikit(德国凯杰生物)、KAPADNAHyperPluskit(瑞士罗氏公司)。1.1.3主要仪器自动微生物药敏及鉴定分析系统(英国先德公司)、IlluminaMiseq 测序平台(美国Illumina 公司)。1.2方法1.2.1菌株复核常温下解冻,使用灭菌接种环三区法划线培养至 SS 琼脂培养基上,放入 37 恒温培养箱 1618h。纯化细菌,挑选单菌落接种于营养琼脂培养基平板进行第二代培养。API20E试剂条进行生化鉴定,血清分型试剂进行沙门菌血清学鉴定。1.2.2药敏试验采用微量肉汤稀释法,选用CMV3AGNF 药敏板进行药物敏感性试验。共包含7 类 14 种抗
16、生素,包括-内酰胺类:头孢曲松(ceftriaxone,CRO)、头孢西丁(cefoxitin,FOX)、头孢噻芬(ceftiofurn,XNL)、氨苄西林(ampicillin,AMP)和阿莫西林/克拉维酸(amoxicillin/clavulanicacid,AUG-2);喹诺酮类:环丙沙星(ciprofloxacin,CIP)和萘啶酸(nalidixicacid,NAL);大环内酯类:阿奇霉素(azithromycin,AZI);四环素类:四环素(tetracycline,TET);氯 霉 素 类:氯 霉 素(chloramphenicol,CHL);磺胺类:甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑(t
17、rimethoprim/sulfamethoxazole,SXT)和磺胺异恶唑(sulfisoxazole,FIS);氨基糖苷类:庆大霉素(gentamicin,GEN)和链霉素(streptomycin,STR)。大肠埃希菌标准菌株 ATCC25922 作为质量控制菌株,根据美国临床和实验室标准协会指南(CLSIM100S30)判定药敏结果。1.2.3全基因组测序及分析使用 QIAampDNAMiniKit 试剂盒提取核酸。使用KAPADNAHyperPluskit 构建 DNA 文库。参考 IlluminaMiseq 平台使用说明进行测序。使用 Trimmomatic11软件对测序数据进行
18、质控,使用 SPAdes12软件进行基因组组装。使用 snippy(v4.6.0)流程(https:/ LT2(NCBI 编号:NC_003197)13作为参考基因组。即使用 BWA-mem(v1.2.0)将自测的基因组映 射 到 参 考 基 因 组,SAMtools(v1.12)14和FreeBayes(v1.3.5)识别 SNPs15,Gubbins(v2.4.1)16识别并去除同源重组,SNP-sites(v2.5.1)17提取核心 SNP。使用 IQ-TREE(v1.6.10)18构建系统发育树,选择一般时间可逆核酸替代模型和 GAMMA 替代速率估算模型,并设置 1000 次 Boo
19、tstrap 抽样。使用 ITOL 在线网站(https:/itol.embl.de/)进行系统发育树美化。根据 PubMLST 分型方案,利用 MLST 软件对组装的基因组进行多位点序列分型检测。使用ABRicate 软件(https:/ 综 合 抗 生 素 耐 药 性 数 据 库(ComprehensiveAntibioticResistanceDatabase,CARD)19进行抗生素耐药基因(antibioticresistantgenes,ARGs)检测。从 snippy 输出中检测喹诺酮耐药决定区(quinoloneresistance determining region,QRD
20、R)相 关 基 因568疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202302150043(gyrA、gyrB、parC 和 parE)的点突变。1.3统计学分析采用 R(v4.0.3)软件进行统计分析及结果可视化。使用 Fisher 确切概率法,比较鸡源和猪源鼠伤寒沙门菌对抗生素的耐药率差异。使用 Mann-Whitney 检验,比较鸡源和猪源鼠伤寒沙门菌 多 重 耐 药 及 携 带 ARGs 数 量 的 分 布 差 异,P0.05 为差异有统计学意义
21、。2结果2.1药敏结果鸡源和猪源鼠伤寒沙门菌 14 种抗生素的耐药结果(表 1),除对 FOX 和 CIP 未检测到耐药外,36 株菌对 12 种抗生素均有不同程度的耐药,其中鸡源菌和猪源菌对 AMP、NAL、TET、CHL 和 FIS 的耐药率60.00%。两株鸡源菌(GZ21和 GZ23)对 14 种抗生素都不耐药,所有的猪源菌对 AUG-2 都不耐药。猪源菌对 TET 的耐药率为100.00%,高于鸡源菌(P0.05)。2.2多重耐药结果鸡源和猪源鼠伤寒沙门菌耐药谱结果(表 2),鸡源菌为 1 类耐药,5 类耐药和 6 类耐药,而猪源多重耐药为 37 类耐药。鸡源 3 类耐药及以上菌株为
22、 66.67%,猪源 3 类耐药及以上菌株为 100.00%,两者都是以 5 类耐药为主(40.00%)。36 株鼠伤寒沙门菌共有 18 种耐药谱,其中鸡源菌 9 种,猪源菌 11 种。6 类耐药的耐药谱 AMP-NAL-TET-CHL-(SXT-FIS)-GEN 和 AMP-NAL-表 1鸡源和猪源鼠伤寒沙门菌抗生素耐药率Table1AntibioticresistanceratesofS.Typhimuriumstrainsofchickenandpork抗生素鸡源(n15)猪源(n21)P值耐药株数耐药率(%)耐药株数耐药率(%)-内酰胺类头孢曲松16.67314.29 0.858头孢西
23、丁00.0000.00头孢噻呋16.67314.29 0.858氨苄青霉素1066.671885.71 0.343阿莫西林/克拉维酸16.6700.00 0.864喹诺酮类环丙沙星00.0000.00萘啶酸1173.331466.67 0.951大环内酯类阿奇霉素00.0029.52 0.623四环素类四环素960.0021100.00 0.007氯霉素类氯霉素960.001466.67 0.953磺胺类甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑746.671257.14 0.778磺胺异恶唑1066.672095.24 0.070氨基糖苷类庆大霉素746.67942.86 1.000链霉素426.671361
24、.90 0.080注:.不符合检验条件,未统计检验表 2鸡源和猪源鼠伤寒沙门菌耐药谱Table2AntibioticresistancepatternsofS.Typhimuriumstrainsofchickenandpork来源耐药种类耐药谱菌株数耐药率(%)合计a鸡源13(86.67)13(20.00)TET213.33NAL16.6754(26.67)(CRO-XNL-AMP)-NAL-CHL-FIS-GEN16.67(AMP-AUG-2)-NAL-CHL-(SXT-FIS)-GEN16.67AMP-NAL-CHL-(SXT-FIS)-GEN16.67AMP-NAL-TET-FIS-S
25、TR16.6766(40.00)AMP-NAL-TET-CHL-(SXT-FIS)-GEN320.00AMP-NAL-TET-CHL-(SXT-FIS)-STR213.33AMP-NAL-TET-CHL-FIS-(GEN-STR)16.67猪源21(100.00)3TET-FIS-STR14.761(4.76)48(38.10)AMP-TET-FIS-STR314.29(CRO-XNL-AMP)-TET-FIS-STR29.52(CRO-XNL-AMP)-TET-CHL-(SXT-FIS)14.76NAL-AZI-TET-CHL14.76AMP-NAL-TET-FIS14.76(CRO-XNL
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