基于核因子κB信号通路观察...方对溃疡性结肠炎小鼠的影响_苏晓兰.pdf
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1、基金项目:国家自然科学基金项目();国家重大疑难病中西医协作试点项目(国中医药办医政发 号);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助项目()作者简介:苏晓兰(.),女,博士,主任医师,研究方向:中医药防治胃肠疾病的临床与基础研究,:.通信作者:魏玮(.),男,博士,主任医师,研究方向:中医药防治胃肠疾病,:.基于核因子 信号通路观察清热化湿调枢方对溃疡性结肠炎小鼠的影响苏晓兰,卿香丽,张 涛,王 琳,张格知,姚梦茜,魏 玮,(中国中医科学院望京医院脾胃病科,北京,;功能性胃肠病中医诊治北京市重点实验室,北京,;成都中医药大学,成都,)摘要 目的:基于核因子()信号通路,探讨清热化湿调枢
2、方对溃疡性结肠炎()小鼠的作用及机制。方法:只无特定病原体()级 小鼠随机选取 只为正常组,其余小鼠均给予.葡聚糖硫酸钠()水溶液建立 小鼠模型。模型评价后,只小鼠随机分为模型组、美沙拉嗪组、清热化湿调枢方高、中、低剂量组。后 组分别给予.、.、.()清热化湿调枢方混悬液.灌胃;美沙拉嗪组给予.()美沙拉嗪混悬液.灌胃;其余小鼠给予.纯水灌胃,均 次,干预 。干预过程中测量小鼠体质量,干预结束后计算疾病活动指数(),测量小鼠结肠长度,苏木精伊红染色后观察远端结肠组织病理学形态,测定结肠核因子()和磷酸化 ()水平,计算 值,实时荧光定量()检测结肠白细胞介素()、肿瘤坏死因子()、趋化因子()
3、的 水平。结果:与模型组比较,美沙拉嗪组、清热化湿调枢方高剂量组、中剂量组小鼠体质量增加、结肠长度一定程度恢复,结肠组织病理炎症减轻,干预前后 差值增加(均 .);、值、的 水平降低(.)。结论:清热化湿调枢方能够改善 小鼠症状、修复结肠黏膜,机制可能与抑制 信号通路激活,从而抑制炎症有关。关键词 结肠炎;溃疡性结肠炎;清热化湿调枢方;结肠组织;核因子 信号通路;炎症介质;作用机制;实验研究 ,(,;(),;,):()():.(),.,.,.(),.(),(),(),(),(),(),()():,(.),(.):,;中图分类号:.;文献标识码:溃疡性结肠炎(,)是一种累及结直肠的慢性非特异性炎
4、症,多数研究认为其发病与遗传、肠道菌群失调、免疫功能紊乱引起的炎症损伤相关。该病病程长,常呈反复发作,其治疗难以取得满意的结果,且随着服药时间延长,不良反应日益明显,已成为全球难治性疾病之一。葡聚糖硫酸钠(,)结肠炎动物模型被广泛用于研究 的病因、发病机制及药效等。核因子(,)信号通路是介导炎症的经典通路,该通路被激活后可引发广泛的炎症介质的转录,如白细胞介素(,)、肿瘤坏死因子(,),导致炎症损伤,在 的发病中起关键作用。清热化湿调枢方是治疗 的常用方,该方可提高治疗 的有效率,改善症状,减轻肠道炎症。基础研究表明,方中败酱草、木香具有抗炎作用,可降低 大鼠结肠组织、的水平,改善 大鼠结肠病
5、理组织形态。但清热化湿调枢方对 诱导的 小鼠炎症介质的影响和作用机制尚不清楚。因此,本研究通过 诱导小鼠建立 模型,基于 信号通路,阐述清热化湿调枢方治疗 可能的作用机制。材料与方法.材料.动物 只 周龄雄性 小鼠,体质量(),无特定病原体(,)级,购于北京斯贝福生物技术有限公司,动物许可证号为(京)。饲养于中国中医科学院针灸研究所 级动物房。饲喂以实验动物普通饲料,不限制进食及饮水,光照和黑暗循环,室温 ,湿度 。本实验经中国中医科学院针灸研究所伦理委员会批准(伦理审批号:)。.药物葡聚糖硫酸钠(,美国,批号:)。用 电 子 天 平 称 取 溶 质.,溶解在 的纯水中,配成.的 溶液。造模第
6、 天开始配液,根据小鼠数量和饮水量 (只),计算所需配液量,天配液 次,保证溶液新鲜。清热化湿调枢方的中药组成为乌梅 、败酱草 、秦皮 、儿茶 、黄连 、当归 等。将 剂生药折合为免煎颗粒 (由中国中医科学院望京医院颗粒药房提供)。用精密天平称取清热化湿调枢方颗粒.,溶于 纯净水中,即为高剂量清热化湿调枢方混悬液。取 高剂量溶液等比稀释及 倍稀释,分别得到中、低剂量混悬液。美沙拉嗪肠溶片(,德国,批号:),取.该药片,去外衣后溶于 蒸馏水中,即为美沙拉嗪混悬液。将配制的溶液 储备,使用前恢复常温,摇匀。.试剂与仪器 抗体(上海贸易有限公司,批号:);重组 ()抗体(上海贸易有限公司,批号:);
7、(,美国,货号:);()(,瑞士,货号:);引物(武汉擎科创新生物科技有限公司)。六一电泳仪电源(北京六一仪器厂,型号:);其林贝尔水平摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司,型号:);六一迷你电泳槽(北京六一仪器厂,型号:);君意湿转转印系统转印槽(北京君意东方电泳设备有限公司,型号:);荧光定量 仪(,瑞士,型号:);超微量分光光度计(,美国,型号:)等。.方法.分组及造模 参照 教授的方法制备 结肠炎小鼠模型。先将 只 小鼠适应性喂养 ,随机抓取 只小鼠为正常组,剩余的 只小鼠自由饮用.水溶液 。疾病活动指数(,)评分用于评价造模成功与否。在造模结束后计算 评分,纳入 评分 分的小鼠。结果
8、 只小鼠均造模世界中医药 年 月第 卷第 期成功。将 只小鼠随机分为模型组,清热化湿调枢方高、中、低剂量组,美沙拉嗪组,每组 只。.干预方法 参考中药药理研究方法学中给药剂量方法,计算小鼠给药剂量。从造模结束当天(第 天)开始分别予以清热化湿调枢方高、中、低剂量组小鼠.()、.()、.()清热化湿调枢方混悬液.灌胃;给予美沙拉嗪组小鼠.()美沙拉嗪混悬液.灌胃;正常组和模型组小鼠给予.纯净水灌胃。各组均给药 次,连续 ,期间不限制进食饮水。.检测指标及方法.评分干预结束后,参考 等的评估方法,根据小鼠体质量、大便性状和粪便隐血情况(每天均需记录),计算各组小鼠 评分。评分 (体质量下降分数 大
9、便性状分数 便血分数).结肠组织形态学观察 干预结束后,麻醉处死小鼠,分离小鼠结肠,测量结肠长度。光学显微镜观察结肠远端长约 组织的苏木精伊红(,)染色切片。.检测)结肠组织蛋白提取:在冰浴条件下,向磨碎的结肠组织加入新鲜配制的裂解液,离心(离心半径.,离心 )后取上清,以 法定量分析蛋白浓度,并将上清液分装冻存备用。):先后配置好 的分离胶和 积层胶,每孔上样,电泳。)转膜及抗体杂交:按“三明治法”用湿转法转膜,转膜后用 封闭液 封闭过夜。室温一抗()水平摇床 ,大量 冲洗 次,次;加入室温二抗(),重复上述操作。)显影:将 显影液加于 膜上,曝光、显影、定影,用图像分析软件()以 为内参,
10、计算二者的相对表达量。.实时荧光定量()检测结肠组织总 的提取依据 说明书进行,提取后用超微分光光度计测定总 浓度;根据 第一链 合成试剂盒说明书配置逆转录体系,用 仪合成;取.管,配置以下定量 体系:.、.基因引物.、逆转录产物.、双蒸水.,.预变性 后,.变性 ,.退火 ,.延伸 ,总共进行 个循环。以 为内参进行半定量分析,将得到的结果根据 法处理,特异性引物序列见表。表 引物序列目的基因引物序列():.统计学方法采用 .统计软件进行数据分析,计量资料以均数 标准差(?)表示。若计量资料同时满足正态分布(检验)和方差齐性(检验),组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用 检验。若未同
11、时满足上述条件,则采用()检验。组内比较采用配对 检验。以 .为差异有统计学意义。结果.各组小鼠一般情况适应性喂养 期间,各组小鼠一般情况可,精神无异常。造模期间未出现小鼠死亡,所有小鼠均出现肛周血渍,且小鼠精神状态差、活动迟缓、喜蜷卧。干预结束后,各组小鼠一般情况均有恢复,仅模型组仍有部分小鼠活动迟缓。.各组小鼠体质量变化情况 干预前,与正常组比较,各组小鼠体质量均下降(均 .)。干预后,各组小鼠与干预前比较体质量均增加(均 .)。其中,模型组和清热化湿调枢方低剂量组小鼠体质量较正常组明显降低(均 .)。清热化湿调枢方高、中剂量组、美沙拉嗪组小鼠干预前后体质量差值明显高于模型组和正常组(均
12、.)。见表。.各组小鼠 评分比较干预前,模型组、美沙拉嗪组、清热化湿调枢方高、中、低剂量组小鼠 评分较正常组升高(均 .)。与干预前比较,干预后除正常组外,各组小鼠的 评分均降低(.)。干预后,与正常组比较,模型组、清热化湿调枢方低剂量组 评分均升高(均 .);与模型组比较,清热化湿调枢方中剂量组、美沙拉嗪组 评分降低(均 .)。除模型组外,干预前后各组 评分差值均高于正常组(均 .);美沙拉嗪组、清热化湿调枢方高剂量、中剂量组 评分差值明显高于模型组(均 .)。见表。,表 各组小鼠体质量变化情况(?,)组别干预前干预后干预前后体质量差值正常组.模型组.美沙拉嗪组.清热化湿调枢方高剂量组.清热
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