柴胡疏肝散对糖尿病周围神经...及坐骨神经电生理变化的影响_王阳阳.pdf
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1、安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Jul,27(7)柴胡疏肝散对糖尿病周围神经病变大鼠瞬时受体电位香草酸亚型1/降钙素基因相关肽通路及坐骨神经电生理变化的影响王阳阳1a,黄霄云2,冯茂胜1b作者单位:1枣庄矿业集团中心医院,a神经电生理科,b体检科,山东 枣庄277000;2复旦大学附属华山医院手外科肌电图室,上海200040 摘要:目的探究柴胡疏肝散对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)/降钙素基因相关肽(CGRP)通路及坐骨神经电生理变化的影响。方法2019年12月至2020年9月,
2、从北京生命科学研究所动物实验中心购入SD大鼠,采用高脂饲料+小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射法建立DPN大鼠模型,分为对照组、模型组、弥可保组(175 g/kg)、低中高剂量柴胡疏肝散(3.15、6.30、12.60 g/kg),每组5只,造模成功后,连续给药8周。8周末检测各组大鼠摆尾温度阈值,肌电图仪检测大鼠运动神经传导速度(MNCV)及其支配肌复合运动动作电位的波幅(AMP)、潜伏期(LAT)的变化。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血清TRPV1、CGRP、肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素-1(IL-1)mRNA的水平;苏木精-伊红(HE)染色观察坐骨神经组织病理变化;
3、蛋白质印迹法检测坐骨神经组织中TRPV1、CGRP、TNF-、IL-1蛋白水平。结果与对照组 (33.151.28)s、(1.370.06)ms、(41.485.36)m/s、(12.321.55)mV 相比,模型组大鼠坐骨神经周围观察到大量浸润性巨噬细胞和单核细胞,并伴有广泛的轴突脱髓鞘,摆尾温度阈值(48.672.65)s、LAT(3.680.18)ms升高,MNCV(30.263.65)m/s、AMP(4.580.26)mV降低,血清及坐骨神经中TRPV1、CGRP、TNF-、IL-1 mRNA或蛋白水平升高(P0.05);与模型组相比,弥可保组、低中高剂量柴胡疏肝散组单核细胞浸润减少,
4、脱髓鞘程度减轻,摆尾温度阈值 (37.751.45)s、(45.612.38)s、(41.741.68)s、(38.211.36)s、LAT (1.620.08)ms、(2.920.12)ms、(2.030.09)ms、(1.690.08)ms 降低,MNCV (38.564.85)m/s、(33.633.21)m/s、(35.423.35)m/s、(38.574.14)m/s、AMP (11.951.02)mV、(7.610.75)mV、(9.350.92)mV、(11.891.03)mV 升高,血清及坐骨神经中TRPV1、CGRP、TNF-、IL-1 mRNA或蛋白水平降低(P0.05)。
5、结论柴胡疏肝散可能通过抑制TRPV1/CGRP通路表达,减轻大鼠坐骨神经损伤,达到保护周围神经的作用,可能作为DPN潜在的治疗药物。关键词:糖尿病神经病变;柴胡疏肝散;瞬时受体电位香草酸亚型 1;降钙素基因相关肽;坐骨神经;大鼠,Sprague-DawleyEffects of Chaihu Shugan powder on TRPV1/CGRP pathwayand electrophysiological changes of sciatic nerve in DPN ratsWANG Yangyang1a,HUANG Xiaoyun2,FENG Maosheng1bAuthor Affi
6、liations:1aDepartment of Neuroelectrophysiology,1bDepartment of Physical Examination,Central Hospitalof Zaozhuang Mining Group Zaozhuang,Shandong 277000,China;2EMG Room of Hand Surgery,Huashan Hospital Affiliated to Fudan University,Shanghai 200040,ChinaAbstract:ObjectiveTo investigate the effects o
7、f Chaihu Shugan powder on transient receptor potential vanlloid 1(TRPV1)/calcitonin gene-related peptide(CGRP)pathway and electrophysiological changes of sciatic nerve in rats with diabetic peripheral neuropathy(DPN).MethodsFrom December 2019 to September 2020,SD rats were purchased from the Animal
8、Experiment Center of Beijing Institute of Life Sciences,and the DPN rat models were established by high-fat diet and intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin(STZ).The rats were divided into control group,model group,micobalamin group(175 g/kg),low,medium and high-doseChaihu Shugan powder
9、(3.15,6.30,12.60 g/kg),with 5 rats in each group.After successful modeling,the rats were treated for 8 weeks.At the end of the 8th week,the tailflick threshold temperature was measured.The motor nerve conduction velocity(MNCV)and the amplitude(AMP)and latency(LAT)of the compound motor action potenti
10、al in the innervating muscles of rats were measured by electromyography.The mRNA levels of TRPV1,CGRP,tumor necrosis factor-(TNF-)and interleukin-1(IL-1)were detected by real-timequantitative PCR(qRT-PCR);the histopathological changes of sciatic nerve observed by hematoxylin eosin(HE)staining;the pr
11、oteinlevels of TRPV1,CGRP,TNF-and IL-1 were detected by Western blotting(WB).ResultsCompared with those in the controlgroup(33.151.28)s,(1.370.06)ms,(41.485.36)m/s,(12.321.55)mV,a large number of infiltrating macrophages and monocytes药学研究引用本文:王阳阳,黄霄云,冯茂胜.柴胡疏肝散对糖尿病周围神经病变大鼠瞬时受体电位香草酸亚型1/降钙素基因相关肽通路及坐骨神经
12、电生理变化的影响 J.安徽医药,2023,27(7):1312-1317.DOI:10.3969/j.issn.1009-6469.2023.07.009.1312安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Jul,27(7)were observed around the sciatic nerve in the model group,accompanied by extensive axonal demyelination,the tailflick threshold temperature(48.672.65)s and
13、 LAT(3.680.18)ms increased,MNCV(30.263.65)m/s and AMP(4.580.26)mV decreased,the mRNA and protein levels of TRPV1,CGRP,TNF-and IL-1 in serum and sciatic nerve were higher(P 0.05);compared with those in the model group,the monocyte infiltration and demyelination degree were decreased in methycobal gro
14、up and low,medium and high dose Chaihu Shugan powder group,the tailflick threshold temperature(37.751.45)s,(45.612.38)s,(41.741.68)s,(38.211.36)s and LAT(1.620.08)ms,(2.920.12)ms,(2.030.09)ms,(1.690.08)ms decreased,MNCV(38.564.85)m/s,(33.633.21)m/s,(35.423.35)m/s,(38.574.14)m/s and AMP(11.951.02)mV,
15、(7.610.75)mV,(9.350.92)mV,(11.891.03)mV increased,the mRNA and protein levels of TRPV1,CGRP,TNF-and IL-1 in serum and sciatic nerve were lower(P 0.05).Conclusion Chaihu Shugan powder can alleviate injury of sciatic nerve and protect the peripheral nerve by inhibiting the expression of TRPV1/CGRP pat
16、hway,which may be a potential therapeutic drug for DPN.Key words:Diabetic neuropathies;Chaihu Shugan powder;Transient receptor potential vanlloid 1;Calcitonin gene-related peptide;Sciatic nerve;Rats,Sprague-Dawley糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一组代谢性疾病,与胰岛素分泌受损或细胞对该激素作用的抵抗有关1。糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral
17、 neuropathy,DPN)是DM最复杂的病理改变之一,据估计,大约一半的DM病人存在这种情况2-3。因此,探究DPN的致病机理及影响因素,对于预防严重的DPN并发症至关重要4。柴胡疏肝散近年来被广泛用于治疗多种病症,可疏肝理气、活血止痛,如2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)合并高脂血症等5。瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanlloid 1,TRPV1)可在多种物理、化学因素刺激下参与痛觉整合、抗炎、调节胃肠等生理和病理过程6。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGR
18、P)是由感觉神经元释放的一种肽类物质,可将感觉信息传递给中枢系统以调节神经活动7。研究证实,过表达 CGRP能够促进神经血管扩张,增加血流,改善DPN8。同时,TRPV1激活后可促进CGRP等神经递质的释放,具有扩张血管和利尿的作用9。因此本研究通过建立 DPN 大鼠模型,检 测 应 用 柴 胡 疏 肝 散 治 疗 DPN 大 鼠 后 对TRPV1/CGRP通路的影响,以期发现柴胡疏肝散在DPN中的作用途径。1材料与方法1.1材料1.1.1动物2019年12月至2020年9月,从北京生命科学研究所动物实验中心 合格证号为 SYXK(京)2015-0002 购入40只SPF级SD雄性大鼠,体质量
19、范围为150180 g,饲养在适宜的温度和湿度下。本研究符合一般动物实验伦理学原则。1.1.2药品柴胡疏肝散:柴胡、陈皮各6 g,白芍、枳壳、川芎、香附各4.5 g,炙甘草1.5 g,由广州致信药业有限公司提供,药材经冷水浸泡2 h,常规两煎,混合煎液并过滤,经水浴蒸发浓缩成含生药1.26 g/mL的浓缩药,高压灭菌后冷藏备用。弥可保(江苏卫材药业有限公司,批号20190318);链脲佐菌素(streptozotocin,STZ;美国Sigma公司,批号20190607);兔抗鼠 TRPV1、CGRP、肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-,TNF-)、白细胞介素-1(i
20、nterleukin-1,IL-1)一 抗(英 国 Abcam 公 司,货 号 ab120099、ab272713、ab215188、ab197447);HE染色试剂盒(德国默克公司,批号G1120);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)试 剂 盒(美 国 赛 默 飞 公 司,货 号A53225);考马斯亮蓝试剂盒(上海康朗生物科技有限公司,货号KL-D3297)。1.1.3实验设备GIS-500 凝胶成像仪(上海艾研生物科技有限公司,货号1708195);肌电图仪(丹麦丹迪医疗公司,型号Keypoint-4);血糖仪(拜耳医药保健有限公司,型号拜安捷 2);CX43 光
21、学显微镜(济南欧莱博电子商务有限公司,货号CX43)。1.2方法1.2.1模型建立随机选取5只大鼠为对照组(给予普通饲料喂养),其余大鼠用于造模。造模大鼠采用高脂饲喂4周,以诱发胰岛素抵抗。随后大鼠禁食 14 h,再给予小剂量 STZ(25 mg/kg,溶于 0.1 mol/L、pH 4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,将STZ配置为1%的溶液,经0.22 m的微孔滤膜过滤除菌)。对照组给予等量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。3 d后从尾静脉采血,用血糖仪测定空腹血糖(fasting blood sugar,FBG),FBG13.8 mmol/L,确定为DM大鼠,用于实验。DM大鼠再继续高糖高脂饲喂8周
22、,使用肌电图仪对大鼠下肢坐骨神经的感觉和运动传导速度进行检测,若大鼠感觉或运动传导速度减慢超过11%,则表示成功建立DPN模型10。在实验过程中有5只大鼠死亡或造模失败,成功建立DPN模型30只。1.2.2分组与给药将DPN模型大鼠随机分为模型组(n=5)、弥可保组(n=5)、低中高剂量柴胡疏肝散组(每组 n=5)。参考文献 11 弥可保组按 1 次/1313安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2023 Jul,27(7)天,175 g/kg剂量灌胃给药,参考文献 12 柴胡疏肝散低中高剂量分别按照1次/天,3.15 g/kg、6.
23、30 g/kg、12.60 g/kg灌胃给药,连续给药8周。1.2.3各组大鼠摆尾温度阈值检测给药8周后,将大鼠放置于宽松的笼内,露出尾部,用恒温加热仪(每分钟加热2),加热水温,水温从20 开始将鼠尾浸入水中约2 cm,鼠尾因水温过高而摆动并露出水面时记录水温,此时水温即为摆尾温度阈值。1.2.4各组大鼠运动神经传导速度(MNCV)的测定第8周末采用1%戊巴比妥钠0.4 mL/100 g腹腔内注射麻醉,使用肌电图仪检测大鼠下肢MNCV,观察 MNCV 及其支配肌复合运动动作电位的波幅(AMP)、潜伏期(LAT)的变化。在腘窝下12 cm处经皮插入 2个针电极(电极间距 1 cm)用方波(10
24、15 mA,0.1 ms脉波宽,频率1 Hz)刺激神经,在距刺激电极23 cm处的同侧胫前肌记录肌肉动作电位。两个刺激部位间的距离用弯脚规测量,运动神经在两个刺激部位间的传导时间为潜伏期差,计算MNCV(距离/潜伏期差值),记录AMP、LAT变幅。1.2.5qRT-PCR 法检测大鼠血清 TRPV1、CGRP、TNF-、IL-1 mRNA水平采用腹主动脉取血,离心分离血清,80 保存备用。Trizol 法提取总RNA,将 RNA 逆转录合成 cDNA 行 qRT-PCR 扩增。反应体系(20 L):10 L 2SYBR Mix,1 L cDNA模板,0.5 L正向引物和0.5 L反向引物,8
25、L双蒸水。反应条件:95、5 min,95、10 s,60、30 s,72、2 min的 40个循环,72、10 min。2Ct方法对mRNA表达水平进行定量,并标准化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。见表1。1.2.6HE染色观察大鼠坐骨神经病理学变化解剖后取坐骨神经组织于4%多聚甲醛中固定,制备石蜡切片,切片经脱蜡、水化后,用苏木素染色 10 min,滴加伊红染液复染5 min后,梯度乙醇脱水、二甲苯透明,中性树脂封片,光学显微镜下观察坐骨神经组织病理变化。另切除约50 mg大鼠坐骨神经组织,用于蛋白质印迹法检测。1.2.7蛋白质印迹法检测大鼠坐骨神经中TRPV1、CGRP、TNF-
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