GLP-1类似物合成及其治疗糖尿病的功效学研究.pdf
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1、提要糖尿病是以高血糖为主要特征的慢性代谢性疾病,各国的发病率呈明显 上升的趋势,但是现有的治疗药物多是通过单一途径发挥作用,并且存在一 定的副作用。因此,寻找一种通过多种途径发挥作用、高效低毒的治疗药物 显得尤为重要。胰高血糖素样肽-1(GLP-1)作为一种机体内具有多种生理 功能的生物活性多肽成为糖尿病治疗药物研究的热点。本研究拟通过固相 多肽合成技术生产出新型的GLP-1类似物,并探讨其治疗糖尿病的作用,力 图开发一种全新的糖尿病治疗药物。研究结果表明:合成的GLP-1类似物粗 品纯度达2 6.0 3%,纯品纯度达9 2.3 8%,质谱检测显示化合物的分子量为 3 2 9 7.4。GLP-
2、1类似物的最大耐受剂量达到2 5 00 ug kg-1,因此可以安全的 用于糖尿病治疗。给予Wistar大鼠40mg kg的S TZ,同时饲以高脂饲料,可以获得稳定的具有高血脂为特征的糖尿病动物模型。GLP-1类似物治疗2 周可以明显地减少糖尿病大鼠的进食量和饮水量;降低糖尿病大鼠的血糖和 血脂水平;提高糖尿病大鼠的血清胰岛素和C肽含量;GLP-1类似物对于S TZ 引起的胰岛损害有明显的保护作用,可以增加糖尿病大鼠表达胰岛素阳性细 胞率;GLP-1类似物对于糖尿病引起的皮肤改变有明显的改善作用。因此,本研究中的GLP-1类似物是通过多种途径在糖尿病治疗中发挥作用的。关键词:胰高血糖素样肽-1
3、,糖尿病,动物模型,淋巴细胞转化,胰岛 素,C肽,转化生长因子氏,免疫组化,进食量,饮水量,脏器指数,高血 糖,高脂血症,糖尿病肾病,血糖,总胆固醇,甘油三酯,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白。目 录英文缩略词第一篇综述.1弓I言.I第一章 糖尿病治疗药物研究进展.1第一节 促进胰岛素分泌剂.I第二节胰岛素增敏剂.3第三节胰岛素.6第四节糖异生抑制剂.8第五节晓葡萄糖昔酶抑制剂.8第六节醛糖还原酶抑制剂.9第七节蛋白非酶糖化抑制剂.10第八节其他新方向.10第二章 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)研究进展.12第一节GLP-1的生化特性.13第二节GLP-1的生理作用.14第三节国内外GLP-1及其
4、类似物的研发现况.15第三章固相多肽合成技术研究进展.19第一节多肽合成方法比较.19第二节固相合成多肽的聚合物载体及连接分子.21第三节多肽的固相合成.22第四节固相合成多肽的检测.25第四章糖尿病动物模型研究进展.26第一节化学物质诱导动物模型.26第二节自发性遗传动物模型.29第三节胰腺部分切除动物模型.31第四节转基因动物模型.31第二篇GLP-1类似物的合成及治疗糖尿病功效研究.33第一章GLP-I类似物的合成研究.33第一节实验材料.33第二节实验方法.34第三节实验结果.36第四节讨论.36第二章GLP-1类似物治疗糖尿病的功效研究.38第一节实验材料.3 8第二节实验方法.40
5、第三节实验结果.44第四节讨论.5 7结论.72附图.73参考文献.82中文摘要.I英文摘要.6攻读博士学位期间发表论文情况 致谢吉林大学博士学位论文英文缩略词ACEI AGEs AR Boc Con A DCC DCM DM DMF DMSO DPP-IV ES I FFA Fmoc GLP-1 GLUT4 GS K-3 HD HDL HFF HPLC I GF-1IL-1 iNOS血管紧张转换酶抑制剂 蛋白非酶糖基化终产物 醛糖还原酶叔丁氧碳基伴刀豆球蛋白A碳二亚胺法二氯甲烷糖尿病二甲基甲酸胺二甲亚飒二肽酶I V电喷雾电离脂肪酸N-笏甲氧竣基胰高血糖素样肽-1葡萄糖转运载体4糖原合成酶激酶
6、-3 高剂量高密度脂蛋白高脂饲料高效液相色谱胰岛素样生长因子白细胞介素-1 诱导NO合成酶ipi v腹腔注射静脉注射IRLD胰岛素抵抗 低剂量吉林大学博士学位论文LDLMALDIMDMeOHMSMTTNCPAI 1PCPGPLA-MCIPMAPPARPTPa s eRXR低密度脂蛋白基质辅助激光解吸电离中剂量甲醇质谱四甲基偶氮喋盐正常对照纤溶酶原激活物抑制剂1阳性对照胰高血糖素原聚丙交醋胰岛素微囊对乙酰基苇酯过氧化物酶体增殖激活受体磷酸酪氨酸磷酸酶维甲素受体s cSI SOD STZ TC TFA TG TIS TZDs皮下注射刺激指数超氧化物岐化酶 链掘佐霉素 胆固醇三氟乙酸甘油三酯 三异丙
7、基硅烷 曝唾烷二酮类吉林大学博士学位论文第一篇综述 引言2型糖尿病是由多种病因引起的代谢紊乱。其特点是由于胰岛素抵抗伴 随胰岛素相对不足,或胰岛素分泌缺陷伴有或不伴有胰岛素抵抗,使葡萄糖 摄取利用减少,从而引发高血糖,导致糖尿病。病变累及心、肾、肝、眼等 器官,造成多种器官的慢性损伤、功能障碍甚至衰竭。随着社会经济的发展 模式转变及社会的老龄化,其患病率在世界范围内呈现出上升趋势,成为继 心脑血管疾病、恶性肿瘤之后的又一严重危害大众健康的慢性非传染性疾 病。目前对其病因虽尚未完全清楚,但多数认为它是遗传因素与环境因素长 期相互作用的结果。上个世纪80年代以来,全球和我国糖尿病患病病人数显著增加
8、。2 00 3 年IDF报告全球糖尿病病人已超过1.94亿,预计到2 0 2 5年这个数字将增加近 一倍(3.33亿)。中国糖尿病患病率在过去20年上升近3倍以上,20岁以上人 群中糖尿病患者由1 9 8 0年的1.0%上升到1 9 9 6年的3.2%,患病率虽低于美 国,但我国人口基数大,估计患病人数约4000万,占全球糖病病人的1/5,超过美国1 6 00万和欧洲2 000万之和。在我国发病人群中,以2型糖尿病为主:1型糖尿病占5.6%,2型糖病占93.7%,其它类型糖尿病仅占0.7%。并且 在我国糖尿病并发症问题非常严重。糖尿病学分会200 1年对我国大陆(除西 藏以外)各省市大医院住院
9、的糖尿病病人并发症进行调查,发现3/5病人合 并高血压或心脑血管病变,1/3合并糖尿病肾病,1/3合并眼病。73%糖尿病 患者患有一种以上的并发症。可以说我国整个糖尿病防治形势十分严峻。但 是目前的防治措施却满足不了形势的需要。因此,国家将糖尿病作为重点攻 关的领域,投入了大量的人力和物力。这极大推动了我国糖尿病治疗药物研 究的进程。第一章糖尿病治疗药物研究进展近年来,糖尿病治疗药物研究取得了很大发展。下面将对糖尿病治疗药 的进展情况进行详细的总结。第一节促进胰岛素分泌剂2型糖尿病患者往往伴有继发性的B细胞功能缺陷。胰岛素分泌促进剂 吉林大学博士学位论文可促使胰岛B细胞分泌更多的胰岛素以降低血
10、糖水平。1磺酰胭类胰岛素分泌促进剂:磺酰胭类药物作用于胰岛B细胞膜上磺酰胭受体而促进胰岛素释放,现 已发展到第三代。第一代有甲苯磺丁胭(D8 6 0)、氧磺丙胭。它们的作用弱,维持时间短。第二代有格列本胭(优降糖)、格列毗嗪(美毗达、迪沙及其控 释片瑞易宁)、格列齐特(达美康)、格列喳酮(糖适平)主要(9 5%)从胆汁肠 道排泄、较少引起肾功能损害,适用于肾功能轻、中度不良的糖尿病。他们 作用较第一代强,降糖作用维持时间可达24h。但这种长时间的降糖作用极 有可能导致低血糖。第三代主要以格列美胭(亚莫利)和格列喳酮为代表。第 三代除具有一、二代的作用外,还能增加组织对胰岛素的敏感性而发挥降血
11、糖作用,本品作用强,起效快,作用维持时间较第二代药物短(8-1 Oh),导 致低血糖的可能性减小。14周的研究表明,格列美胭1、4和8 mg每日用药1 次对2型糖尿病疗效良好。格列美胭的最大特点在于其特异性地作用于胰岛 细胞工 ATP通道而儿乎不与心血管系统的,ATP通道作用。但有20%-3 0%的2型糖尿病患者对磺酰麻类药物治疗的原发效应较差,在有效的患者中每年约有5%-10%变成继发性失效。2非磺酰胭类胰岛素分泌促进剂:这类药物于进餐时口服,可使胰岛素快速释放,能有效降低餐后血糖。品种有美格列定及其类似物:瑞格列奈(诺和龙、孚来迪)、美格列奈、瑞格 列定、纳格列定、吗咻胭类化合物BTS 6
12、 7 5 8 2等。其中瑞格列奈在维持非肥胖 的2型糖尿病血糖水平方面,明显优于格列毗嗪。瑞格列奈(诺和龙)与磺胭 类优降糖的相同点为:均可抑制钾离子外流,使B细胞膜去极化,开放钙离 子通道,增加钙离子内流。不同点为:使ATP敏感的钾离子通道关闭,使它 们与3个不同的位点结合,一个位点对瑞格列奈的亲和力很高,但对优降糖 亲和力很低,与这个位点结合,使得瑞格列奈促进胰岛素释放和降血糖作用 强于优降糖。瑞格列奈和优降糖均可高亲和性地与第二个位点结合,而与第 三个位点结合的只有优降糖,瑞格列奈则不行。总的效应瑞格列奈(诺和龙)的降糖作用是优降糖的10倍。3肽酶抑制剂:2吉林大学博士学位论文GLP-1
13、是30个氨基酸的多肽,为葡萄糖依赖型的胰岛素分泌促进剂,是 目前所知最强的胰岛素分泌促进激素,对2型糖尿病,其可防御性的增强胰 岛素分泌。但GLP-1在体内可被二肽酶IV(DPP-IV)迅速降解川。所以凡能抑 制DPP-1 V活性的物质则能促进胰岛素释放而发挥调节血糖的作用。现有报道 的肽酶抑制剂有硼酸类化合物川和含富基的化合物NVP-DPP-7 2 8 151 o第二节胰岛素增敏剂1 PPARy 激动剂:曝唾烷二酮类(Thiazolid ined iones,TZDs)胰岛素抵抗在糖尿病的发生发展中起着极为重要的作用。抵抗有获得性 及遗传性两种,1型病人仅有获得性胰岛素抵抗,2型病人的胰岛素
14、抵抗是双 重性的。曝哇烷二酮类是新开发的一种很有前途的胰岛素增敏剂,包括有 t r ogl i t agon c i gl i t azon pioglitazon engl i t azon rosiglitazon 161 O这类药物对胰岛索分泌没有影响,因而要求患者必须有胰岛素存在。代表 药物是r os i gl i t azon(罗格列酮)和pi og 1 i t azon(毗格列酮)。二者降糖机理 如下:体内胰岛素主要对脂肪、骨骼肌、肝脏等外周组织和器官发挥作 用,在这些组织和器官中富含一种过氧化物酶体增殖激活受体(peroxisonme pr ol i f er at or一act
15、ivated receptor.PPAR)。PPAR 属核受体,有a、B(也称6)、丫三种亚型,罗格列酮可高亲和力地和其中的PPAR Y受体结合。通过调节多种基因的表达而控制糖和脂肪的代谢;可以使糖代谢关键基 因如苹果酸酶、葡萄糖激酶的转录增强,最终提高胰岛素敏感性;抑制 肿瘤坏死因子和瘦素基因的表达;促进脂肪细胞解偶联蛋白表达,促进能 量消耗,提高胰岛索敏感性。近来研究还发现可降低游离脂肪酸水平,升高 棕色脂肪组织含量,改善能量消耗。与食物同服并不影响罗格列酮的吸收,其生物利用度达99%,服药后lh达峰值,半衰期约3.511,罗格列酮主要在肝 脏代谢清除,64%经尿排出,23%经消化道排出。
16、该药达到最佳作用效果的 时间约需12周。罗格列酮适合单独或联合用于2型糖尿病患者,尤适用于代 谢综合症的患者。理论上不引起低血糖,发生率仅为0.5%。研究发现罗格 列酮有促排卵的作用,需要避孕的妇女不宜使用罗格列酮。罗格列酮有效日 剂量是2 mg-8 mg,不宜超过2 0 mg,剂量超过12 mg不会再对疗效发生影响,可 早餐顿服或分早、晚二次服用。由于同类药物曲格列酮因肝毒性作用已在欧 3吉林大学博士学位论文美禁用,所以在使用罗格列酮的过程中应注意肝功能的变化,已有心功能和 肝功能损害的患者慎用。该药1 9 9 9年5月已在美国上市,商品名为Avand ia。Pi ol it azone于1
17、 9 9 9年7月获得FDA批准,由武田公司(商品名Taked a)和礼来 公司(商品名Act os)联合引入美国市场,资料表明,经26周治疗后患者平均 HbA水平降低1%(30理组)和1.4%(45理组),而在初次治疗的患者中,每次 服用时相应的血糖水平下降为14%和2 6%。其血糖降低作用与罗格列酮相比 无显著性差异或稍低,但在降血脂方面较好,可显著降低甘油三酯和升高高 密度脂蛋白水平。在肝毒性指标上,FDA顾问委员会得出的结论为:安全、几乎未表现出或没有肝毒性产生的可能性,但服用中仍须注意肝功能监测,pi ogli razon经肝脏代谢后主要由肠道排出,15%3 0%经肾排泄。Piogl
18、iazone起始推荐剂量为1530nlg,每天服用一次;每日最大推荐剂量 为4 5mg。曝唾烷二酮类适用于2型糖尿病患者,和目前常用的口服降糖药物 及胰岛素均可联用或替代治疗。2 PPARa及PPAR Y的共同激动剂PPAR家族的另一个重要成员是PPAR a,它主要在对脂类有极高分解代谢 活力的器官组织如肝脏中表达。PPAR a可被许多结构不同的化合物如降脂 药苯氧丁酸酯类所活化。另有报道PPAR a是血浆脂蛋白代谢酶的基因表达调 控器,激活PPAR a可降低血中的甘油三酯水平及改善肝脏中的不正常脂类 代谢。最早报道的能同时激动PPAR a和PPAR Y的化合物是S mi th KlineBo
19、echam公司合成的烷氧取代竣酸类化合物。化合物KRP-2 9 7也有较强的PPAR a及PPAR Y共同激动作用。3双胭类口服降血糖药作为增敏剂双胭类口服降糖药并不直接刺激胰岛素分泌,而主要通过抑 制肝脏的糖异生,降低肝糖输出以及促进骨骼肌、脂肪等外周胰岛素靶组织 对葡萄糖的摄取和利用来改善机体的胰岛素敏感性。主要品种有二甲双服、苯己双胭和丁双胭。二甲双肌:因较少引起乳酸酸中毒,故使用较为广泛。二 中双月瓜能促进胰岛素与受体结合、磷酸化及酪氨酸激酶的活化、提高糖原合 成酶活性。此外.该药还能明显抑制肝细胞的胰岛素抵抗(IR)的发展。4吉林大学博士学位论文二甲双月瓜能明显改善糖尿病患者的糖耐量
20、和高胰岛素血症。由于该药口 服后能在肠粘膜高浓度聚集,抑制肠道的糖吸收.因而对餐前、餐后血糖均 有明显的降低作用。该药还能降低血浆脂肪酸(FFA)和甘油三酯(TG)水 平.降低纤溶活性和抗血小板的粘附、聚集.而且还能降低血浆纤溶酶原激 活物抑制剂1(PAI-1)水平,因此有一定的抗动脉硬化作用。二甲双胭的副作用主要是因药物在肠道聚集所致的消化道症状。老年合 并有心、肾功能障碍者还有发生乳酸酸中毒的危险。研究显示,该药降糖作 用在5 0 0-3 0 0 0 mg之间存在着剂量依存关系.其改善胰岛素敏感性的效果一般 需用量在1 5 00 mg/d以上才明显。而这恰好是我国使用该药的极量。因此,有必
21、要对二甲双胭的用量与胰岛素增敏效果间的关系进行进一步研究网。4游离脂肪酸(FFA)释放抑制剂目前认为,FFA是引起IR的最主要非激素物质之一。对糖尿病患者在降 糖的同时,还需积极降低其血浆FFA水平以增进靶细胞对胰岛素的敏感性。常用的FF A释放抑制剂主要有:4.1烟酸诱导剂 包括烟酸及其衍生物是临床常用的抑制FFA释放的降 脂药,但其作用时间过短,降低血浆FFA和血糖的作用也不明显。4.2 腺昔Ai受体激动剂腺昔A受体主要分布在肾脏、脑和脂肪组织,与G1蛋白结合后可降低细胞浆内cAMP水平,从而抑制脂肪分解。S and oz公司 开发的S DZ-WAG-9 9 4对人脂肪细胞中胰岛素抑制脂肪
22、分解与葡萄糖输送作用 敏感性较高,能明显增强胰岛素抑制脂肪分解的作用,降低脂肪组织的FFA 释放。4.3 贝特类降脂药 即苯氧乙酸衍生物。目前在临床较为常用。研究表 明,氯贝特可同时降低血浆FFA和血糖水平。并能抑制胆石形成。苯扎贝特 可明显改善糖尿病患者的胰岛素敏感性,但降糖作用轻微叫。5胰岛素降解抑制剂胰岛素降解抑制剂是通过抑制胰岛素酶活性及抑制胰岛细胞外途径的 降解,从而改善胰岛素抵抗。降低高血糖及高胰岛素血症。这类药物较有应 用价值的是氯喳及羟基氯喳。它们可改善1型糖尿病患者的血糖血脂和胰岛 素水平,短期服用可见效。曾报道一名存在胰岛素抵抗的糖尿病患者,胰岛 5吉林大学博士学位论文素用
23、量达1 5 000 U/d,经氯喳治疗后降至700U/d。这类药物长期服用对人体 的影响尚在研究。6维甲素受体(RXR)激活剂这类药可提高胰岛素外周靶细胞(肌肉、脂肪)对胰岛素的敏感性,降低 血糖、血脂(尤其是甘油三酯)和内源性胰岛素水平,其机制至今未明。可与 TZDs合用,提高胰岛素的敏感性和减少外源性胰岛素的用量,其临床疗效和 毒副作用尚待临床进一步研究和评估。7降压药目前常用的降压药中,利尿剂和a-受体阻滞剂可降低胰岛素敏感性和 使糖耐量恶化.故不宜用于糖尿病患者。血管紧张转换酶抑制剂(ACEI)和a 受体阻滞剂是否有肯定的改善胰岛素敏感性的作用尚有争议。若干研究显 示ACEI不仅可降低
24、血压,还可降低血糖和改善糖耐量,并有明显的肾脏保护 作用。*受体阻滞剂的作用机理与ACEI相类似.且能降低血浆TG水平和提 高高密度脂蛋白(HDL-C)水平。钙拮抗剂只有持续作用的缓释类型才有胰 岛素增敏作用,速效类因能迅速扩张血管引起反射性交感神经兴奋,大量释 放的儿茶酚胺能明显抑制胰岛素在骨骼肌的作用并抑制胰岛素分泌,反而导 致胰岛素敏感性下降.因此糖尿病患者不宜使用速效类拮抗剂。第三节胰岛素1动物胰岛素I.1重结晶胰岛素重结晶胰岛素第一代胰岛素,从猪或牛胰腺提取结晶而成,免疫原性强 容易导致过敏及抗体产生,造成血糖控制不理想。在发达国家已被淘汰。1.2单峰及单组分胰岛素将结晶的胰岛素进一
25、步纯化,抗体生成率下降50%以上。但自从人胰岛 素问世后,发达国家也已经很少使用。2人胰岛素包括半合成及基囚重组工程合成的人胰岛素,纯度最高,抗体生成大大 减少,更易吸收,根据病人状态、血糖水平、活动量、进食量等不同需要选 用短、中、长效及短效、中效胰岛素预混的制剂。近年来出现的品种有以下6吉林大学博士学位论文儿种:2.1超短效胰岛素(诺和锐)诺和诺德公司的No vol og和礼莱公司的Huma 1 og,二者均为速效胰岛素类 似物,与常规的人胰岛素相比,作用时间不随剂量增大而延长,更符合生理 要求;餐时即刻注射,更灵活;与血糖同步性最好,极少发生低血糖,是最 理想的泵用胰岛素。发生低血糖反应
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