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基于不同配体的NSE检测方法研究进展.pdf
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1、第34卷第3期2023年9 月【文章编号】2096-2835(2023)03-0348-09中国计量大学学报Journal of China University of MetrologyVol.34 No.3Sep.2023DOI.10.3969/j.issn.2096-2835.2023.03.004基于不同配体的NSE检测方法研究进展梁展玮1-2,彭涛,胡亚琳1-2,屈子裕,路(1.中国计量大学生命科学学院,浙江杭州310 0 18;2.中国计量科学研究院,北京10 0 0 2 93.长春市计量检定测试技术研究院,吉林长春130 0 12)【摘要】目的:通过综述神经特异性烯醇化酶(neu
2、ron-specific enolase,NSE)检测方法研究进展,为NSE灵敏准确定量检测方法开发提供有力解决方案。方法:结合文献和数据库搜索,总结NSE的结构特征与基本性质,系统介绍近年来基于不同配体的NSE检测方法与技术的研究进展。结果:作为目前最可靠的小细胞肺癌诊断标志物,NSE已被应用于开发多种检测方法与技术,并被应用于临床中肺癌的诊断、预后及疗效评估。结论:目前尚无统一的金标准方法来检测NSE,但已经开发出了多种基于不同配体的检测方法,它们可以用于恶性肿瘤等重大疾病的早期诊断、病情监控和预后评估,为临床提供技术支持。【关键词】神经元特异性烯醇化酶;小细胞肺癌;肿瘤标志物;临床诊断;
3、体外检测【中图分类号】R730.43各欣1,焦学诗玛1.,王一楠,俞晓平1【文献标志码】AAdvances in the detection methods for neuron-specific enolasebased on different ligandsLIANG Zhanweil-2,PENG Tao”,HU Yalin-?,QU Ziyu,LU Xin?,JIAO Xueshimal-?2,WANG Yinan,YU Xiaoping(1.College of Life Sciences,China Jiliang University,Hangzhou 310018,China
4、;2.National Institute of Metrology,Beijing 100029,China;3.Changchun Institute of Metrology,Changchun 130012,China)AbstractJ Aims:This paper aims to provide a powerful solution for the sensitive,accurate quantitationdetection of neuron-specific enolase(NSE)by reviewing the research progress of the NS
5、E detection methods.Methods:Combined with literature and database search,a variety of NSE detection methods and technologiesbased on different ligands developed in recent years were introduced.Results:As the most reliable diagnosticmarker of small cell lung cancer at present,NSE has been applied to
6、develop a variety of detection methods andtechnologies,and has been used in the clinical diagnosis,prognosis,and efficacy evaluation of lung cancer.Conclusions:There is no unified gold standard method for detecting NSE nowadays,but a variety of detectionmethods based on different ligands have been d
7、eveloped,which can be used for the early diagnosis,diseasemonitoring,and prognosis evaluation of major diseases such as malignant tumors,thus providing technicalsupport for clinical use.Key words NSE;small cell lung cancer;cancer marker;clinical diagnosis;in vitro diagnostics【收稿日期】2023-02-19【基金项目】第七
8、届青托工程项目(No.2021QNRC001)【通信作者】俞晓平(196 3一),男,教授,博士,主要研究方向为生物计量及生物安全等。E-mail:中国计量大学学报网址:10第3期肺癌号称“第一癌症杀手”,分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两大类,具有隐匿性强、恶化程度高、预后差等特点,是目前全球死亡率最高的恶性肿瘤疾病。血清肿瘤标志物的检测具有取样方便、检测快捷、创伤小等特点,在恶性肿瘤诊断和预后等方面应用广泛。临床检验与研究中,常用的肺癌血清标志物包括癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19 片段(CYFRA 2 1-1)、糖类抗原12 5(CA-125)、鳞状细胞癌抗原(SCC)和神经元特异性烯醇化
9、酶(NSE)。其中,NSE是目前诊断小细胞肺癌最可靠的血清肿瘤标志物,同时在肺癌的发展监测、预后判断和疗效评估等方面也具有重要的参考价值。1NSE的基本性质脊椎动物体内存在3种烯醇化酶亚基,包括主要存在于肝肾组织、肌肉组织、神经组织的亚基、亚基和亚基,3种亚基以二聚体形式组成了5种不同的烯醇化酶同工酶。其中,特异性存在于神经元和神经内分泌细胞中的、型同工酶为神经元特异性烯醇化酶(NSE)。NSE是一种蛋白质大分子物质,具有相对分子质量(约7 8 0 0 0 u)、酸性强、性质稳定、催化活性及在正常人体液中含量极低等特点 2-31。它是一种 金属活化的金属酶(辅因子为Mg+)4,能够在糖酵解途径
10、中催化2-磷酸-D-甘油酸(PGA)脱水为磷酸烯醇丙酮酸(PEP),以及催化糖异生中PEP水合为PGA。糖酵解可以为神经元提供足够的能量以维持神经元代谢,因此NSE几乎存在于所有类型的神经元中 5。NSE是神经元、外周神经内分泌组织、胺前体摄取和脱羧细胞的高度特异性标志物,体液和组织中NSE水平升高可能伴随这些组织的恶性增殖。虽然NSE作为一种通用的神经内分泌标志物并不能区分不同亚型的神经内分泌肿瘤(NET s),但其升高与肿瘤分化不良有关 6-)。NSE是目前诊断小细胞肺癌(SCLC)的首选肿瘤标志物,7 5%的SCLC患者伴有NSE水平升高 1,NSE在非小细胞肺癌(NSCLC)、NET1
11、2、神经母细胞瘤 13、肾细胞癌 14 等肿瘤病理条件下也有表达(表1)。此外,NSE已被证明可作为脑损伤的潜在候选生物标志物,例如脑缺血 15-16 、脑出血 17 、癫痫发作 18 、心肺后昏迷患者梁展玮等:基于不同配体的NSE检测方法研究进展NSE阅值/类型(ng mL-1)SCLC12.5NSCLCNET神经母细胞瘤脑损伤肾细胞癌2NSE的检测方法NSE的体外检测主要有3种方式:1)依赖NSE部分肽段结构特征的质谱分析方法 2 4-2 7 ;2)依赖于NSE本身烯醇化酶活性的酶活性测量方法 2 8 13)依赖于NSE识别位点的配体测定方法。对于NSE而言,质谱检测方法虽然准确度和灵敏度
12、高,但受限于复杂的样本前处理过程和对大型设备的需要,难以满足高通量、高效率检测的要求。而酶活性测量方法的特异性较差,导致检测结果准确度不高。然而依赖于配体特异性结合的检测方法却是目前NSE常用的临床检验技术,该类方法中的配体主要包括抗体、分子印迹聚合物、核酸适配体。2.1基于抗体的免疫检测方法使用抗原-抗体反应原理的免疫检测方法因具有检测速度快、操作简便、成本低、易于推广等优点,是临床检验中蛋白质分析的首选方法 2 9。然而免疫分析法存在稳定性差、灵敏度相对较低、假阳性率高等问题。NSE和 NSE前体 NNE之间基本没有免疫交叉反应性 30 ,可以减少交叉反应引起的假阳性结果。基于抗体的免疫方
13、法检测NSE主要有“三明治”夹心模式与竞争模式两种形式。349心脏骤停 19-2 0 和创伤性脑损伤的恢复 2 1-2 3 等。因此,准确定量检测体液中NSE水平,对肺癌等疾病的临床诊断、发展程度和治疗效果有重要意义。表 1 与 NSE相关的疾病Table 1 Diseases associated with NSE疾病12.5100参考标志物类型文献SCLC诊断与分期的最佳标志物非特异性标志物与嗜铬细胞蛋白A一起作为NET诊12断的最佳标志物疾病分期与预后的13相关标志物脑损伤程度的相关15-23标志物疾病分期与转移的14相关标志物113502.1.1放射免疫测定法(RIA)RIA是临床检测
14、NSE最早使用的免疫测定技术,其基本原理是:将放射性元素标记抗原/抗体作为检测探针,采用夹心模式或竞争模式,通过测量探针上放射性元素的放射强度,实现对样本中NSE的定量检测。基于3H放射性元素标记的竞争模式RIA可以在总体积为0.55mL加标血清中检出1ng至10 0 ng的NSE317。将具有更强放射性的12 5I作为标记元素,能够有效提高RIA检测NSE的灵敏度 32-33。虽然RIA具有灵敏度高、特异性好等优点,但使用放射性同位素易造成放射线辐射和污染等问题,应用发展受到限制。2.1.2酶联免疫吸附测定法(ELISA)1972年Engvall 和Perlmann34l首次建立了ELISA
15、,极大地简化了免疫测定程序,迅速成为临床检验的金标准。用于NSE检测的ELISA包括直接法和夹心法。AghajanianG35开发了直接法ELISA,用碱性磷酸酶标记的NSE抗体直接特异性识别NSE,通过直接测量酶标抗体催化底物产生的信号实现检测,但该方法准确度和灵敏度不高。基于夹心模式的ELISA经过抗体固定一抗原捕获一杂质洗涤一检测抗体识别一洗涤一酶标抗体结合等步骤,在酶标板上形成“抗体-NSE-抗体-酶标抗体复合物,最后通过测量酶标抗体催化底物产生的信号实现NSE检测,抗体特异性的捕获与识别以及干扰物的去除,大大提高了NSE检测的灵敏度和准确度 36 ,可用于复杂基质分析。Abcam公司
16、生产的ELISA试剂盒(货号ab233626)可以在90 min内检出50.8 pg/mL的NSE。然而,ELISA方法操作繁琐且耗时。2.1.3电化学免疫传感器电化学免疫传感器的基本原理是:抗体固定在电极表面用于捕获目标物,被具有电活性标签中国计量大学学报式的比率型电化学免疫传感器,将响应电流的比值作为定量测定NSE质量浓度的依据,检测范围为1pg/mL至1g/mL,检测NSE的检出限为42.6pg/mL。其双信号输出特性为定量分析提供内置校正因子,消除背景干扰,显著提高了检测的动态范围、重现性、准确度和灵敏度。而通过信号放大策略可以进一步提升检测灵敏度 40 ,Fang 等 41 设计了一
17、种基于银增强的超灵敏电化学免疫分析方法如图1(a),检测NSE的检出限可达8.0 fg/mL。Co-assenCS/3D-GNSLSVInKCIYAblYAb.(a)银增强电化学免疫传感器 41)PolymerSynthesisPotentiostatKOHDH,0EDC.DMAFcHCL,C,NO,FeClMonomerPyr-EpxSpinCoaterSPohmerActiveAntibodyAnti-NSEBovineseruntAlbumineAriigenNSE第34卷silver.depositionAg+BSAEIS&CVReferencePolymetMeasurementsP
18、(Pyr-Epx)PolymerDepositioBareTO-PETElectrodeAuNPsThreeFlectrodeSystemWorkinsElectrodeEleetrodeA/AgCTTO-PETDningPolymntPolymerCoatedsurtacesurfaceRotationRotationAgNPSCounterElectrodePatinumElectrodehbricationRotation的检测探针识别,根据对电化学活性标签和电极TEP之间电子的转移来定量检测复杂基质中的目标物,无需分离和洗涤步骤 37,具有装置简单、灵敏度更高(可达每毫升皮可克(pg)
19、级至飞母托克(fg)级)、检测快速和成本低等优点。LI等 38 1设计了一种基于夹心模式的单电极电化学免疫传感器,用Ru(bpy)+标记NSE抗体作为检测探针,在电极表面形成夹心复合物产生电信号实现NSE检测。Huang等 39 开发了一种基于夹心模BSASTEPAti-NSE(a)银增强电化学免疫传感器 41)图1电化学免疫传感器示意图Figure1Schematic diagram of electrochemical immu-nosensorsAntigenNSEBiosensorFabricationSteps第3期在电化学免疫传感器中,免标记电化学传感器具有结构和检测步骤更简单、检
20、测时间更短等优点。光电化学(PEC)传感器是一种常见的免标记电化学传感器,有光电转换能力的电极产生光电流,当NSE被电极上的抗体特异性结合后,电极的阻抗变大,光电流减弱,光电流的变化与NSE质量浓度相关。Soomro等 42 以抗体修饰钨酸镍电极,尿酸作电子供体,构建了PEC免疫传感器,光电流反应随着NSE的质量浓度增加而逐渐减弱,在最佳条件下的检出限为12 0 pg/mL。Liu等 43 构建了基于金纳米星-二硫化钼复合纳米材料的PEC免疫传感器检测NSE,其检出限可低至3.5 pg/mL。但PEC传感器的灵敏度受光电流大小的限制,直接的电化学阻抗谱测量可以提高其灵敏度。Zhang等 441
21、将氧化石墨烯和苯胺通过电化学共沉积到多孔金电极上,构建了一种免标记电化学免疫传感器用于NSE检测,其检出限可低至0.1pg/mL,这种使用贵金属改性电极的方法提高了检测灵敏度,但同时也提高了制造成本。因此,Aydin等 451开发了一种基于环氧取代聚吡咯聚合物涂层一次性锡-氧化物电极的低成本免标记电化学免疫传感器如图1(b),通过阻抗测量来反映NSE质量浓度,在最佳条件下的检出限为6.1fg/mL,且每次检测成本仅$0.0 5,远低于ELISA方法的$5.42。电化学免疫传感器在肿瘤标志物检测方面已取得了很大进展,但高阻抗的抗原、抗体、阻断剂等非目标物可能会在电极表面产生绝缘层,阻碍电子转移而
22、降低信号响应,在一定程度上会限制其分析性能。2.1.4荧光免疫层析方法荧光免疫层析方法是将特异性免疫学反应和高灵敏荧光技术结合起来的一种快速检测技术,在临床诊断和基础研究中具有重要作用。其基本原理是:将含有NSE的样品滴加到样品垫上,NSE与荧光检测探针形成复合物继续在NC膜上层析,被检测线上的抗体捕获并聚集形成荧光信号 46,NSE质量浓度与荧光信号呈正相关。近年来,有机荧光染料 47 、荧光微球 48 、半导体量子点 49 等荧光材料的应用,丰富了荧光免疫层析方法体系,同时也提高了检测灵敏度。Xiao等 49 以梁展玮等:基于不同配体的NSE检测方法研究进展TiOrtppyaciGCEDe
23、posited AuLayer图2 化学发光免疫传感器示意图Figure 2Chemiluminescence immunosensors for NSEdetection351量子点为标记材料制备检测探针,开发了一种能在15min内同时定量检测NSE和癌胚抗原(CEA)的荧光免疫层析方法,检测的质量浓度为550 n g/m L,检测NSE的检出限为42.6 pg/mL。相较于荧光ELISA方法 50 1,荧光免疫层析方法将捕获抗体和探针整合在同一体系中,复杂的洗涤、加样等步骤也被NC膜上的层析作用所取代,因此具有检测速度快、操作简单、成本低等优点,能够实现NSE的即时检测。然而,免疫层析法存
24、在较大的批内差和批间差;此外,荧光信号需要紫外光源来激发获取,增加了检测的成本和复杂度。2.1.5化学发光免疫分析方法化学发光免疫分析方法是将高灵敏化学发光技术与特异性免疫反应相结合的一种新型免疫分析方法,其发光能量来自化学反应。Mao等 51 用碱性磷酸酶(ALP)标记抗NSE抗体作检测探针,成功构建了夹心模式的化学发光免疫传感器,当样品中存在NSE时,形成“探针-NSE-捕获抗体”免疫复合物,经洗涤加入发光底物,在ALP的催化作用下迅速发光如图2(a),其检出限为44pg/mL,完成检测需要至少2 0 0 min。该方法易于扩展实现高通量检测,用于临床血清样品的大规模筛选,但较繁琐的操作过
25、程和较长的分析时间限制了其广泛应用。EDC.NHSYEDC.NHSCL(a)ircomplex+TPtASPAACSPAACCLsubstrate(a)化学发光免疫传感器(b)T,C,T,TO,Hybrids+Ircomplex+TPrAprtppyllacIrtppyltacaclHopyhfacac)Ab,(b)电化学发光免疫传感器HRPALP96-well plateCPSMSCEAmAbs1NSEmAbsICEAantigenNSE antigenHRPlabeledCEAmAbs2ALP labeledNSEmAbs2NSEAnbgenBS.A352而电化学发光(ECL)免疫分析方法
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