ASFV、PRV和PCV2多重荧光定量PCR检测方法的建立和应用.pdf
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1、中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 8 期2023 年 8 月Vol.45,No.8Aug.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202209026ASFV、PRV和PCV2多重荧光定量PCR检测方法的建立和应用李玲1,邹宏2,徐璐2,宋新宇2,朱明哲2,王程2,王震2,刘业兵2,马小军1*,夏应菊2*(1.甘肃农业大学 动物医学院,甘肃 兰州 730070;2.中国兽医药品监察所 国家猪瘟参考实验室,北京 102600)摘要:非洲猪瘟病毒(ASFV)、伪狂犬病毒(PRV
2、)、猪圆环病毒2型(PCV2)是危害养猪业的3种重要病毒,但目前国内外尚无可同时检测这3种病原的方法。为建立一种可同时检测上述3种病原的方法,本研究以ASFV的基因、PRV的基因及PCV2的基因为靶基因,采用Prime 3 web软件分别设计特异性引物和探针。采用相应引物分别构建上述3种靶基因的重组质粒,经测序鉴定后分别作为质粒标准品,并均稀释到1伊105拷贝/滋L后按照体积比1颐1颐1混匀后作为模板,采用方阵法对引物、探针、酶和各反应条件等的优化,初步建立ASFV、PRV和PCV2多重荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法标准曲线Ct值与相应质粒标准品浓度均存在良好的线性关系,相关系数(R
3、2)均大于0.99。利用该方法同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病原,结果显示,本实验建立的该方法仅特异性扩增ASFV、PRV和PCV2,与其他病原均无交叉反应,特异性强;分别利用该方法与已公布的中华人民共和国农业农村部公告第172号中ASFV荧光定量PCR检测方法、PCV2荧光定量PCR方法(GB/T 35901-2018)、PRV荧光定量PCR检测方法(GB/T 35911-2018)对10倍倍比稀释(1.0伊104拷贝/滋L1.0伊100拷贝/滋L)
4、后的pUC57-ASFV-B646L、pUC57-PRV-gE、pGEMT-PCV2-rep质粒标准品1颐1颐1的混合物检测,结果显示该方法对3种质粒标准品的最低检测限均为10拷贝/滋L,相同或略高于上述各病原的单一qPCR检测结果,表明本实验建立的该方法敏感性较高;选取3个稀释度的质粒标准品分别按1颐1颐1比例混合后进行组内和组间重复性试验,结果显示组内组间变异系数均小于3%,重复性好。利用本实验建立的方法和上述3种病原标准检测方法对114份临床样品检测,结果显示,本实验建立的方法对ASFV、PRV和PCV2检测的的阳性样品数分别为10份、10份和42份,未发现混合感染现象,与3种病原的标准
5、方法相比符合率均为100%。以上结果表明,本研究建立的ASFV、PRV和PCV2多重荧光定量PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于这3种常见猪病的鉴别诊断和流行病学调查。关键词:非洲猪瘟病毒;猪圆环病毒2型;伪狂犬病毒;多重荧光定量PCR中图分类号:S852.65文献标识码:A文章编号:1008-0589(2023)08-0807-07Establishment and application of multiplex real-time PCR assayfor ASFV,PRV,and PCV2LI Ling1,ZOU Hong2,XU Lu2,SONG Xin-yu2,ZHU M
6、ing-zhe2,WANG Cheng2,WANG Zhen2,LIU Ye-bing2,MA Xiao-jun1*,XIA Ying-ju2*(1.College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.National Swine Fever Reference Laboratory,China Institute for Veterinary Drug Control,Beijing 102600,China)收稿日期:2022-09-28基金项目:十四五国家重点研发计划(20
7、21YFD1801405);兽药行业公益性重点专项(GY202211)作者简介:李玲(1996-),女,甘肃庆阳人,硕士研究生,主要从事非洲猪瘟病毒相关研究.*通信作者:E-mail:;vet_*Corresponding authorAbstract:African swine fever virus(ASFV),porcine pseudorabies virus(PRV),and porcine circovirus type 2(PCV2)arethree important viruses that seriously harm the porcine industry;howeve
8、r,no assay for simultaneously detecting these threepathogens has been developed.In the present study,a multiplex real-time PCR assay was established for the simultaneous detectionof ASFV,PRV and PCV2,through the construction of the corresponding recombinant plasmids.Specific primers and probes wered
9、esigned or cited from highly conserved genomic regions of ASFV(),PRV()and PCV2().After the optimization ofprimers,probes,enzymes,and reaction conditions with the correlation coefficients(R2)above 0.99,the Ct values were linearlycorrelated with the concentrations of the corresponding plasmid standard
10、s and ultimately a multiplex real-time PCR assay wasestablished.Specificity test was carried out on other swine viral pathogens such as CSFV,PRRSV,FMDV,PPV,BVDV,TGEV,which showed that the assay could only specifically detect ASFV,PRV and PCV2,with no cross-reactivity with other pathogens.The sensiti
11、vity of the assay was compared with published standard qPCR assays of ASFV in the Ministry of Agriculture and RuralAffairs of the Peoples Republic of China announcement No.172,real-time PCR method for the detection of PCV2(GB/T35901-2018),real-time PCR method for detection of PRV(GB/T 35911-2018),th
12、e results showed that the minimum detection limitof the multiplex real-time PCR assay for each recombinant plasmid standard were 10 copies/滋L.Three different concentrations ofplasmid were selected for intra-group and inter-group reproducibility tests,and the results showed that both intra-group andi
13、nter-group coefficients of variation were less than 3%,with good reproducibility results.A total of 114 samples were detected bythe multiplex real-time PCR,and positive samples of ASFV,PRV and PCV2 were 10,10 and 42,respectively,with no mixedinfections detected.The compliance rate was all the same(1
14、00%)for our established assay and standard real-time PCR assays.Themultiplex real-time PCR assay established in this study has high specificity,sensitivity,repeatability and was consistent to otherstandard methods,which could be used for the differential diagnosis,epidemiological investigation of AS
15、FV,PRV,and PCV2.Key words:African swine fever virus;porcine circovirus type 2;porcine pseudorabies virus;multiplex real-time PCR随着当前规模化生猪养殖产业的不断发展,养殖场中多种疾病并发感染的情况不断上升,且临床上频繁发生混和、并发或继发感染的情况。非洲猪瘟(African swine fever,ASF)、猪 圆 环 病 毒 病(Porcine circovirus disease,PCVD)和 伪 狂 犬(Pseu-dorabies,PR)是影响生猪生产的重要疫病
16、。ASF对我国养猪业的持续稳定发展构成严重威胁,是各国重点防控的动物疫病。猪圆环病毒2型(Porcine cir-covirus type 2,PCV2)和伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus,PRV)是临床上较常见的可引起猪繁殖障碍的疫病病原,常与其他病原混合感染,造成临床诊断的困难。在病原学检测方法中,多重荧光定量PCR可实现一个反应体系中同时检测多个目标基因,与单一荧光定量PCR方法相比更经济高效。已有研究者针对不同病原建立了多重荧光定量PCR检测方法,如针对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、PRV和PCV2 4种病原的荧光定量PCR方法1,针对CS
17、FV、PCV2和PRRSV 3种病原的荧光定量PCR方法2及针对非洲猪瘟病毒(ASFV)、CSFV和高致病性PRRSV(HP-PRRSV)3种病原的荧光定量PCR方法3,均具有较强的特异性、较好的重复性及较高的敏感性。但国内外尚无可同时检测ASFV、PCV2和PRV的荧光定量PCR检测方法,因此,建立一种能同时灵敏、快速、特异检测的方法,有助于这3种疫病的早期诊断和防控。因此本研究以ASFV基因、PRV基因和PCV2基因为靶基因,筛选特异高效的引物和探针,建立了可快速、特异鉴别检测ASFV、PRV和PCV2的多重荧光定量PCR方法,为这3种病原的鉴别检测提供了一种有效的技术手段。1材料与方法1
18、.1主要实验材料pUC57-ASFV-B646L(3.2伊1010拷贝/滋L)、pUC57-PRV-gE(1.1伊1010拷贝/滋L)重组质粒标准品,PCV2、PPV的病毒DNA,CSFV、PRRSV、口蹄疫病毒(FMDV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的病毒核酸反转录后的cDNA及10份ASF动物实验的阳性样品、10份PR动物实验阳性样品,均由中国兽医药品监察所国家/WOAH猪瘟参考实验室鉴定并保存。94份临床组织中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年808样品(脾、淋巴结和肉制品等)来自山西运城和山西临 汾 的 4 个 屠 宰 场。HS Version(R
19、R006A)、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0(9766)、MiniBEST DNA Fragment Purification KitVer.4.0(9761)、DH5琢感受态细胞(9057),均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;OMAGA plasmid Mi-ni kit(D6943-02)购自北京索莱宝科技有限公司;磁珠法病毒基因组提取试剂盒(DP329-02)购自天根生化科技(北京)有限公司;T4 DNA连接酶、pGEM-T购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司;HyperProbeMixture购自江苏康为世纪生物科技股份有
20、限公司。1.2引物、探针的设计与合成根据NCBI中多个ASFV株(MK333180.1、MN393477.1、NC_001659.2)基因序列的相对保守区域,利用Primer 3 web软件,设计特异性的探针和引物。PCV2引物PCV2-F/R引用GB/T 35901-20184,靶基因为复制酶基因(基因,编码复制酶replicase protein)。PRV引物PRV-F/R引用GB/T 35911-20185,靶基因即基因。PCV2和PRV探针的荧光报告基团和淬灭基团进行了相应调整。实验所用引物序列见表1,均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.3重组质粒标准品的构建与鉴定提取PCV
21、2的DNA,采用引物PCV2-F1/R1经PCR扩增后,纯化回收目的片段克隆至pGEM-T载体,构建的重组质粒,经上海生工生物工程技术服务有限公司测序鉴定正确后命名为pGEMT-PCV2-rep,测定质粒浓度,按基因拷贝数(拷贝/滋L)=6.02伊1023伊质粒浓度(ng/滋L)伊10-9/质粒大小(bp)伊660换算为拷贝数后备用。1.4荧光定量PCR反应条件的优化将质粒标准品 pUC57-ASFV-B646L、pUC57-PRV-gE、pGEMT-PCV2-rep均稀释为1伊105拷贝/滋L后,按照1颐1颐1的体积比混合后加3 滋L作为模板,采用方阵法优化HS酶(5U/滋L)、dNTP(2
22、.5 mmol/L)添加量(0.3 滋L、0.5 滋L、0.8 滋L、1 滋L、1.2 滋L),Buffer添加量(2 滋L、2.5 滋L、3 滋L、3.5 滋L、4 滋L、4.5 滋L、5 滋L),引物和探针终浓度(0.16 滋mol/滋L、0.24 滋mol/滋L、0.32 滋mol/滋L、0.40 滋mol/滋L、0.48 滋mol/滋L)。反应条件为:95 30 s;95 10 s、退火温度分别设置为56、58、60 20 s,45个循环。最终选择Ct值小、荧光强度强、扩增曲线平滑、无非特异性扩增的条件作为优化结果。1.5标准曲线的建立分别选取10倍倍比稀释(1.0伊107拷贝/滋L1
23、.0伊103拷贝/滋L)的pUC57-ASFV-B646L、pUC57-PRV-gE、pGEMT-PCV2-rep质粒标准品,按1颐1颐1混合后取3 滋L作为模板,每个稀释度做3个重复,设灭菌无酶水为阴性对照,按照优化的条件经荧光定量PCR扩增后,以质粒标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的Ct值为纵坐标绘制标准曲线。1.6特异性试验利用本实验建立的方法对CSFV、PRRSV、FMDV、TGEV、BVDV的 cDNA和PPV的DNA分别扩增,以1颐1颐1混合的pUC57-ASFV-B646L、pUC57-PRV-gE、pGEMT-PCV2-rep质粒标准品为阳性对照,以灭菌无酶水为阴性对照,检
24、测该方法的特异性。1.7敏感性试验以1.0伊104拷贝/滋L1.0伊100拷贝/滋L的 pUC57-ASFV-B646L、pUC57-PRV-gE、pGEMT-PCV2-rep质粒标准品1颐1颐1混合后取3 滋L作为模板,灭菌无酶水为阴性对照,利用本研究建立的多重荧光定量PCR扩增。同时对1.0伊104拷贝/滋L1.0伊100拷 贝/滋L 的 pUC57-ASFV-B646L、pUC57-PRV-gE、pGEMT-PCV2-rep质粒标准品分别利用农业农村部第172号公告6、GB/T 35911-20185和GB/T 35901-20184所公布的ASFV、PRV和PCV2标准荧光定量检测方法
25、扩增,比较本研究建立方法与这3种病原标准qPCR方法的敏感性。1.8重复性试验在相同条件下,分别取浓度为1.0伊107拷贝/滋L、1.0伊104拷贝/滋L、1.0伊102拷贝/滋L的 pUC57-ASFV-B646L、pUC57-PRV-gE、pGEMT-PCV2-rep阳性质粒标准品分别1颐1颐1混合后作为模板,分别利用本研究建立的多重荧光定量PCR方法检测,每个浓度的质粒做3个重复。另外,相同的模板放置24 h、48 h、72 h后分别利用本研究建立的多重荧光定量PCR检测,每个浓度做3个重复。分别计算组内和组间重复性试验荧光Ct值的标准差和变异系数,评估其稳定性。实验设灭菌无酶水为阴性对
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