基于UPLC_LTQ Orbitrap Velos MS的创伤性脑损伤代谢组学分析.pdf
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1、:研究生园地基于 的创伤性脑损伤代谢组学分析周惠惠,程桂青,田璐,周愿,李洪春,(徐州医科大学医学技术学院,江苏徐州;徐州医科大学附属医院检验科,江苏徐州)摘要:目的 联合非靶向和靶向代谢组学技术检测创伤性脑损伤(,)差异代谢物,并评估其与病情严重程度及预后的关系。方法 选取徐州医科大学附属医院 年 月至 月就诊的 患者(组)和体检健康者(健康人对照组)各 例,应用超高效液相色谱线性离子阱 静电场轨道阱组合式高分辨质谱()筛选并验证差异代谢物。记录 例 患者入院 内格拉斯哥昏迷评分(,)和伤后 个月格拉斯哥预后评分(,),结合差异代谢物评估疾病严重程度和预后。结果 验证的 个差异代谢物(谷氨酸
2、、尿酸、肌酐和乳酸)存在显著分离趋势,组谷氨酸和乳酸水平显著高于健康人对照组,尿酸和肌酐水平显著低于健康人对照组;随着伤情加重,患者谷氨酸和乳酸水平逐渐升高,尿酸和肌酐水平逐渐降低;影响预后不良的 种代谢物组 曲线下面积()为,敏感性为,特异性为()。结论谷氨酸、乳酸、尿酸和肌酐与 患者病情密切相关,四者联合或可用于预测 的预后。关键词:创伤性脑损伤;代谢组学;生物学标志物;超高效液相色谱线性离子阱 静电场轨道阱组合式高分辨质谱;严重程度;预后中图分类号:文献标志码:,(,;,):(),()()(,),(),:;创伤性脑损伤(,)是由外力作用而导致的脑部损伤,具有较高的死亡率和致残率,是严重威
3、胁人类健康的公共卫生问题之一。格拉斯哥昏迷评分(,)等认知测试具有快速、低成本、无创、易于应用的特点,但由于受检查者的主观判断影响,通常临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ,基金项目:徐州医科大学优秀人才科研启动基金项目()。作者简介:周惠惠,年生,女,硕士研究生,主要从事临床生物化学检验研究。通信作者:李洪春,副教授,:。只作为 的筛查方法。颅脑创伤患者脑监测技术中国专家共识指出,强烈推荐影像学检查作为首选辅助检查,推荐脑生物学标志物检测,如胶质纤维酸性蛋白和泛素羧基末端水解酶 用于识别轻度 患者。但影像学技术费用昂贵,且使许多患者暴露于不必要的电离辐射,增加急诊科的负担,故而开发新的血清生物
4、学标志物有助于提高临床决策规则的作用。本研究旨在利用非靶向和靶向代谢组学方法探索新的 潜在生物学标志物,用于辅助早期诊断、判断病情及预后,并加深对 代谢改变的认识,以期寻找治疗靶点。材料和方法 研究对象 选取徐州医科大学附属医院 年 月至 月就诊的 患者(组)和体检健康者(健康人对照组)各 例进行非靶向分析筛选和靶向分析验证。患者 评分在入院 内根据睁眼反应、语言反应和运动反应 个方面进行评估,分为重型(分,),中型(分,)和轻型(分,);格拉斯哥预后评分(,)在患者伤后 个月进行评估,分为预后不良组(分,)和预后良好组(分,)。收集所有受试者的一般信息和实验室检测指标等临床资料。本研究经徐州
5、医科大学附属医院伦理委员会批准(),所有受试者均知情同意。仪器与试剂 高效液相色谱仪(美国 公司),高分辨质谱仪(美国赛默飞世尔科技公司),离心机(德国 公司)。色谱柱:柱(,);流动相中 相:水(含甲酸乙腈),相:乙腈(含 甲酸水);柱温:;流速:;流动相梯度体系:,;,;,;,。乙腈、甲醇(美国赛默飞世尔科技公司)。样本制备 规范采集 患者创伤 内及 个月后的空腹静脉血标本,、离心,移取 上清液置于 离心管中,加入 蛋白质沉淀剂(甲醇乙腈体积比)涡旋震荡 ,、离心,取上清液 置于离心浓缩仪中干燥,加入 乙腈水(体积比)复溶,离心 ,取上清加入进样小瓶,用于质谱检测。质谱检测 超高效液相色谱
6、线性离子阱 静电场轨道阱组合式高分辨质谱()步骤:进样量为 ,载气为氮气,流速恒定为 ,柱温为 。设置:模式,电喷雾毛细管电压(正离子为 ;负离子为 ),毛细管温度为 ,扫描范围为 ,锥孔电压为 ,锥空气流速为 ,最大进样时间为 ,动态排除为 ,分辨率为 ,分辨率为 。数据处理及统计学分析采用 软件对原始光谱进行数据预处理获得峰强度矩阵,将数据导入 软件进行多元变量统计分析,包括主成分分析(,)和正交偏最小二乘法判别分析(,),交叉验证采用、等参数评价 模型质量,通过 次置换检验评价模型拟合程度。设置单变量统计分析 检验中 和倍数变化(,)或,变量投影重要度(,),作为差异代谢物筛选条件。用
7、软件将差异代谢物导入京都基因和基因组百科全书(,)数据库进行差异代谢物富集通路分析和分层聚类。采用 软件进行统计分析,符合正态分布的计量资料以均数标准差()表示,不符合正态分布的计量资料以中位数(四分位数)(,)表示,计数资料以 和表示,两组间比较采用独立样本 检验,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用 检验;相关性分析采用 相关分析,以 为差异具有统计学意义。结果 两组受试者一般临床特征和生化指标分析 组血清天冬氨酸氨基转移酶和葡萄糖水平显著高于健康人对照组,前清蛋白、总蛋白、清蛋白、球蛋白、肌酐、尿酸、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平显
8、著低于健康人对照组,差异均有统计学意义()。两组受试者年龄、丙氨酸氨基转移酶、尿素和三酰甘油之间的差异无统计学意义。见表。临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ,表 组和健康人对照组一般临床特征和生化指标参数 组()健康人对照组()值年龄(岁)评分天冬氨酸氨基转移酶()(,)(,)丙氨酸氨基转移酶()(,)(,)前清蛋白()总蛋白()清蛋白()球蛋白()(,)(,)尿素()肌酐()尿酸()半胱氨酸蛋白酶抑制剂()葡萄糖()(,)(,)总胆固醇()三酰甘油()(,)(,)高密度脂蛋白胆固醇()(,)(,)低密度脂蛋白胆固醇()两组代谢模式对比结果根据峰强度进行 和 分析。分析显示(图、)两组样本代谢
9、物存在显著差异,阳离子模式()和 分别为 和;阴离子模式()和 分别为 和。分析显示组间存在显著差异(图、),阳离子模式 (),(),;阴离子模式(),(),。次置换试验(图、)阳离子模式 和 分别为 和,阴离子模式 和 分别为 和。火山图用于反映血清中差异代谢物的总体分布情况,见图。注:、,模型,每个点代表一位受试者样本,绝大多数样本都在 可信区间内,显示两种不同的类聚现象;、,模型,横坐标表示主成分得分值,反映组间差异,纵坐标表示正交成分得分值,反映组内差异;、,置换检验模型,与 轴的回归线截距,表明模型不存在“过拟合”现象。图 组与健康人对照组代谢谱临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ,图
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