基于TMA_FMO3_TMAO通路探讨参竹心康方治疗慢性心力衰竭模型大鼠的作用机制.pdf
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1、世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ,实验研究 :基金项目:第七批全国老中医药专家学术经验传承项目(国中医药人教函 号);湖南省科技厅科研计划项目();湖南省中医药研究院科研计划联合重点项目()作者单位:湖南省中西医结合医院,湖南 长沙 ;湖南中医药大学,湖南 长沙 通信作者:赵启,:基于 通路探讨参竹心康方治疗慢性心力衰竭模型大鼠的作用机制赵启赵梦雪袁清照【摘要】目的探讨参竹心康方对慢性心力衰竭模型大鼠的治疗作用及机制。方法将 只 级雄性 大鼠按随机数字表法分为对照组,模型组,参竹心康方低、中、高剂量组,每组各 只。慢性心力衰竭大鼠模型的制备选择腹主动脉缩窄法,治疗组予参竹心康方灌胃,余下两
2、组予生理盐水灌胃,此过程持续 周。末次给药后用小动物超声心动图检查大鼠心功能,检测肝脏黄素单氧化酶 (,)表达水平,法测定血浆 型脑钠肽(,)、氧化三甲胺(,)及粪便中三甲胺(,)的表达,采用 高通量测序法检测大鼠结肠内容物的菌群特征。结果与对照组比较,模型组 、指标水平明显升高,水平明显降低,差异有统计学意义();与模型组比较,参竹心康方低、中、高剂量组 、指标水平明显降低,水平明显升高,差异有统计学意义()。与对照组比较,模型组中 的含量明显升高,差异有统计学意义();与模型组比较,参竹心康方低、中、高剂量组中 的含量明显降低差异有统计学意义()。与对照组比较,模型组中 的表达量明显升高,
3、差异有统计学意义();与模型组比较,参竹心康方低、中剂量组中 含量明显降低,差异有统计学意义()。与对照组比较,模型组大鼠血浆 、含量均明显升高,差异有统计学意义();药物治疗之后,参竹心康方低、中、高剂量组 、含量较模型组均明显降低,差异有统计学意义()。与对照组比较,模型组 、指数值升高,指数值下降,差异有统计学意义()。参竹心康中剂量组 、指数值回调与模型组比较,差异有统计学意义()。肠道菌群的 、多样性分析表明,与对照组比较,模型组大鼠菌群丰度及多样性呈下降趋势,而参竹心康方组大鼠肠菌的丰富度及多样性均明显增加。结论参竹心康方对慢性心力衰竭大鼠的保护作用可能与改善肠道菌群紊乱、调控 通
4、路及其相关蛋白的表达相关。【关键词】参竹心康方;慢性心力衰竭;肠道菌群;通路【中图分类号】【文献标识码】,(,;,)【】,;();(),()();世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ,(),(),(),(),(),(),(),(),(),(),【】;心力衰竭是一种致命的并且治疗费用昂贵的疾病,随着人口老龄化,全球负担将急剧增加 。因此,防治心衰刻不容缓。目前西医治疗心衰主要以强心、利尿、扩血管及改善心室重构以及拮抗神经内分泌激活为主 ,主要针对心脏本身症状,不能解决心衰常见的伴发症状,而中医药可以通过多方面、多靶点的相互作用对慢性心力衰竭进行调控和改善。因此,借助中医手段,探究治疗心衰的新角度
5、或许成为未来发展趋势所在。相关研究证实,肠道菌群参与了包括心血管疾病在内的多种疾病的发展,贯穿心血管疾病发展的始终 ,慢性心力衰竭发生后,毛细血管收缩,内脏灌注减少,胃肠道出现缺血,表现为肠道通透性增高,继而导致肠道细菌移位和肠源性内毒素血症。小肠是食物中胆碱转运吸收的场所,但若饮食中的胆碱超过了小肠中吸收上限,胆碱就会到达大肠,并被肠道菌种中的 酶代谢为 ;被吸收入血后,在肝脏 的氧化作用下转变为 。基于众多 研 究 提 出 了“心 衰 肠 道 假说”,认为疾病状态下,肠道内菌群的构成、功能、形态、代谢产物继而发生改变,肠道细菌易位、致病菌的增加和循环内毒素水平的上升会加速心力衰竭进程中的炎
6、症及免疫反应,促进心肌细胞的凋亡,加重心力衰竭 ,。参竹心康方是湖南省名中医喻正科主任医师的临床经验方,既往多项研究均证实参竹心康方对慢性心力衰竭疗效显著 ,本课题组在前期预实验中已经初步证实参竹心康方的治疗效果与调节肠道菌群结构有关,但机制尚不明确。因此,本研究以肠道菌群代谢产物为切入点,明确参竹心康方对慢性心力衰竭大鼠肠道菌群及代谢产物的影响,探讨其对慢性心力衰竭大鼠疗效的作用机制。材料与方法 材料 动物 级雄性 大鼠 只,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,动物生产许可证号:(京),动物合格证号:(湘)。饲养条件:温度 ;湿度 。通风良好、环境安静,每日饲以颗粒全价饲料,饮清洁自来水。本
7、研究经湖南省中西医结合医院伦理委员会审核批准(审批号:)。药物参竹心康方:党参 ,麦冬 ,炙黄芪 ,五味子,玉竹 ,丹参 ,田三七 ,黄精 ,葶苈子 ,姜黄 ,泽兰 。免煎颗粒剂,以上中药由湖南省中西医结合医院提供。主要试剂与设备大鼠三甲胺()试剂盒、大鼠氧化三甲胺()试剂盒(上海酶联,货号:);大鼠脑钠素 脑钠尿肽()试剂盒(江西宸曦,货号:);细胞裂解液(北京普利莱,货号:),蛋白定量试世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ,剂盒()(,货号:),丙烯酰胺()(,货号:),四甲基乙二胺()(阿拉丁,货号:),缓冲液()(,货号:),缓冲液()(,货号:),过硫酸铵()(天津致远),甘氨酸()
8、(,货号:),十二烷基硫酸钠()(西陇科学,货号:),(,货号:),膜(,货号:),牛血清白蛋白()(索莱宝,货号:),超敏发光液(赛默飞,货号:),封闭用脱脂奶粉(北京普利莱,货号:),内参一抗:(,),二抗:()(,),目的一抗:(,)、(,)、(,),二抗:()(,)。全自动酶标仪(北京六一,);药品阴凉 冷藏柜(博津,);电热恒温培养箱(上海一恒,);小动物超声显影仪(加拿大 公司,型);高速冷冻离心机(上海卢湘仪,);蛋白垂直电泳仪(北京六一,);小动物人工呼吸机(北瑞未来,);心电图机(深圳市凯沃尔,);超高灵敏度化学发光成像系统(上海伯乐生命医学,);型高通量测序仪(美国 公司)
9、。方法 分组及造模 只大鼠适应性饲养 周后,按随机数字表法分为对照组,模型组,参竹心康方低、中、高剂量组,每组各 只。采用腹主动脉缩窄法,制备模型。实验大鼠腹腔注射 戊巴比妥进行麻醉,打开腹腔,肾动脉分叉上方游离腹主动脉约 ,将腹主动脉平行放置 号钝针头,一同结扎后使肾脏出现缺血,抽出针头,使腹主动脉部分狭窄,检测狭窄处内径小于 。手术以后连续 均给予造模组大鼠腹腔注射 万 青霉素。周以后,左心室射血分数(,)则建模成功 。实验结束时,模型组死亡 只,中高剂量组各死亡 只,低剂量组死亡 只。给药方法大鼠给药剂量根据体表面积法进行折算 ,以成人剂量的大鼠等效剂量为参竹心康方中剂量组,成人临床推荐
10、用量为 ,大鼠等效量按成人的 倍计算,(),参竹心康方低、高剂量组所用药分别为中剂量组药物浓度的 倍及 倍,即 ()、()。造模 周后第 天开始对低、中、高剂量组动物进行治疗,余下两组以生理盐水灌胃,次 ,灌胃量均为 (),整个过程持续周。观察指标 心脏彩超测定药物干预结束后,完善心脏超声检查。予 戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉,剂量选择:。麻醉起效后,对手术台上仰卧位固定大鼠行气管插管术,正压人工通气(频率:次 ,潮气量:)。将连接 生理记录仪的 导管插入大鼠右侧颈总动脉,选用 软件(公司),获取左心室射血分数(,),左室舒张期内径(,)、收缩期内径(,)四项指标信息。检测 表达水平在大鼠肝脏组
11、织中加入 裂解液充分研磨,以离心半径 ,转速 离心 ,将缓冲溶液放入上清液中,煮沸 ,保存。用 蛋质定量试剂盒检测细胞上清中蛋白质浓度。制胶、蛋白加样(孔),分离蛋白;转膜,约 ;室温下振荡封闭 ;加入 ()一抗,过夜;清洗后加入二抗,摇床孵育 ;清洗后 显影,拍照后计算浓度。测定实验结束予 戊巴比妥钠()对大鼠进行腹腔注射麻醉,于大鼠腹主动脉处采血,将留取的血样标本进行离心,以离心半径 ,转速 离心 ,取出血清于冰箱中保存(),按照试剂盒说明书测定血浆 和 含量,取大鼠新鲜粪便按照试剂盒说明书用于 检测。世界中西医结合杂志 年第 卷第 期 ,统计学方法采用 统计学软件和 统计学软件分析数据。
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