基于UHPLC-QE-MS的橘荔散结丸诱导子宫肌瘤细胞凋亡的炎症机制.pdf
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1、基于 的橘荔散结丸诱导子宫肌瘤细胞凋亡的炎症机制谢卓庭王乃平程晓榆关永格李坤寅(.广州中医药大学东莞医院广东 东莞.广州中医药大学第三附属医院广东 广州)摘要 目目的的 运用超高效液相色谱 四极杆 静电场轨道阱串联质谱()技术分析橘荔散结丸的药物成分围绕核因子 ()信号通路探讨橘荔散结丸诱导子宫肌瘤细胞凋亡的炎症机制 方方法法 采用 技术分析橘荔散结丸化学成分 培养原代人子宫肌瘤细胞免疫组化法进行鉴定 实验分为 组空白组常规培养基质组加入 培养米非司酮组加入 /米非司酮含药液培养橘荔散结丸高、低浓度组分别加入 /和 /橘荔散结丸含药液培养 采用流式细胞术检测子宫肌瘤细胞凋亡率采用 法检测子宫肌
2、瘤细胞中、肿瘤坏死因子 ()、白细胞介素()蛋白表达情况采用 技术检测子宫肌瘤细胞中、表达量 结结果果 鉴别橘荔散结丸主要化学成分 个冻干粉与中成药间共有 个 米非司酮组和橘荔散结丸高、低浓度组子宫肌瘤细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均明显高于空白组和基质组(均.)且米非司酮组、橘荔散结丸高浓度组早期凋亡率和晚期凋亡率均明显高于橘荔散结丸低浓度组(均.)橘荔散结丸高浓度组早期凋亡率明显高于米非司酮组(.)橘荔散结丸高浓度组和米非司酮组子宫肌瘤细胞中、蛋白相对表达量均明显高于空白组和橘荔散结丸低浓度组(均.)且橘荔散结丸高浓度组和米非司酮组子宫肌瘤细胞中 蛋白相对表达量均明显高于空白组(均.)橘荔散结
3、丸高浓度组子宫肌瘤细胞中 、蛋白相对表达量均明显低于米非司酮组(均 )米非司酮组、橘荔散结丸高浓度组、橘荔散结丸低浓度组子宫肌瘤细胞中、相对表达量和米非司酮组、橘荔散结丸高浓度组 相对表达量均明显高于空白组(均.)橘荔散结丸高浓度组和米非司酮组、相对表达量均明显高于橘荔散结丸低浓度组(均 .)结结论论 橘荔散结丸化学成分具有抗炎免疫调节作用其治疗子宫肌瘤分子机制与干预肌瘤细胞微环境炎症反应密切相关关键词 橘荔散结丸子宫肌瘤超高效液相色谱 四极杆 静电场轨道阱串联质谱技术炎症:./.中图分类号.文献标识码 文章编号 ()作者简介 谢卓庭女博士主治医师研究方向为中医药治疗妇科肿瘤及生殖障碍基金项目
4、 广东省自然科学基金项目()广东省中管局项目()东莞市社会发展科技项目(高水平医院建设专项)()(.):()()().现代中西医结合杂志 ()./.(.)()(.).()(.)(.).(.)(.).:子宫肌瘤是女性最常见良性肿瘤常伴随经量增多及经期延长、下腹包块、压迫症状可引起不孕或流产 的育龄期女性患过子宫肌瘤 的不孕与子宫肌瘤密切相关 目前西医治疗手段有激素药物和非激素药物(如止血剂、非甾体抗炎药)、手术及放射疗法等这些治疗方式对于有生育要求的女性并不友好而中医药优势明显 子宫肌瘤属于中医“癥瘕”病范畴气滞血瘀证是最常见的临床证型 橘荔散结丸为全国著名妇科泰斗罗元恺教授治疗气滞血瘀型子宫肌
5、瘤的经典方剂临床治疗子宫肌瘤疗效显著 前期团队研究发现橘荔散结丸能够降低子宫肌瘤细胞增殖能力抑制大鼠子宫肌层细胞增殖但该药物发挥作用的化学成分及作用机制尚不明确 超高效液相色谱 四极杆 静电场轨道阱串联质谱()集高效分离、多组分定性和定量于一体既发挥色谱高分离能力又发挥质谱高鉴别能力近年来成为药物分析中一项重要检测技术被广泛用于食品药物分析、医药研究和药物残留检测领域 子宫肌瘤与炎症反应关系密切核因子 ()信号通路是免疫炎症的经典通路孕激素可通过阻断 激活和诱导环氧化酶 ()来抑制子宫收缩 因此本研究运用 技术对橘荔散结丸化学成分进行分析并围绕 信号通路探讨了橘荔散结丸诱导子宫肌瘤细胞凋亡的炎
6、症机制 实验材料与方法 实验细胞选择 年 月 年 月于广州中医药大学第三附属医院妇科住院行子宫全切术或子宫肌瘤剔除术的子宫肌瘤患者 例手术后 内取部分子宫肌瘤组织送病理检查并确诊 本研究经广州中医药大学第三附属医院伦理委员会审核通过()手术室用无菌剪刀获取手术切除子宫肌瘤病灶组织约 立即置于装有冰浴 缓冲液 离心管中 内送实验室行原代培养 试剂与药物、胎牛血清、青链霉素溶液、.胰蛋白酶、缓冲液(美国 公司现代中西医结合杂志 ()货号:.)型胶原酶(德国 公司货号:)鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)免疫组化试剂盒、显色试剂盒(博士德生物技术有限公司)凋亡试剂盒(美国
7、 公司)碘化丙啶(默克公司货号:)米非司酮片(北京紫竹药业有限公司规格:/片)中药饮片(广州至信药业有限公司批号:)橘荔散结片(广州中医药大学第一附属医院批号:)、肿瘤坏死因子 ()、白细胞介素()抗体(北京博奥森生 物 技 术 有 限 公 司 货 号:)()抗体(公司货号:)裂解液、蛋白定量试剂盒(杭州弗德生物科技有限公司)(美国 公司)仪 器 超 高 效 液 相(公 司)高分辨质谱(公司 )超声仪(深圳市方奥微电子有限公司 )色谱柱(公司 .)离心机(上海安亭科学仪器厂)全自动显微照相倒置式系统显微镜(日本 公司)恒温 培养箱(美国 公司 )流式细胞仪(美国 公司)蛋白电泳装置系统(公司)
8、型转移脱色摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)荧光定量 仪(美国 公司)药液制备方法橘荔散结丸冻干粉:将橘核、荔枝核、莪术、川楝子、益母草、小茴香 、乌药 、海藻 、岗稔根 、党参 、何首乌 、续断 、生牡蛎 、风粟壳 粉碎制成粗粉按 料液比加入 酒精回流提取 次每次 收集醇液旋转蒸发仪浓缩(/)至无醇味冷冻干燥冻干粉(质量为 )与原方药材(剂原方药材为 )比为 .橘荔散结丸含药液:橘荔散结丸冻干粉用 培养液稀释溶解配置不同浓度含药液(/、/、/)米非司酮含药液:米非司酮片用研钵研碎根据其分子量计算得出配置 浓度为 /母液需.米非司酮根据实验需要使用时将母液用 液稀释为 /工作液 均用.
9、微孔滤膜无菌过滤 试纸测其 值至中性 冰箱保存备用 橘荔散结丸主要化学成分 技术检测方法 橘荔散结丸冻干粉及橘荔散结片共 个样本每组检测 个样本 色谱条件:色谱柱(.)进样量 流速为./流动相为.甲酸水溶液()和.甲酸乙腈溶液()多步线性洗脱梯度程序:.质谱条件:每个采集周期中质量范围在 之间采用加热电喷雾离子源正、负离子模式检测 参数设置:毛细管温度 鞘气体流速 辅助气体流速 全分辨率为 /分辨率为 碰撞能量/(模式)喷射电压.(正极)或.(负极)子宫肌瘤细胞相关实验方法 细胞培养及免疫组化鉴定原代细胞传至第 代细胞生长融合至 时 多聚甲醛液室温固定 去离子水灭酶活性 封闭液封闭 滴加一抗工
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