基于Zeta电位表征血小板因子4_依诺肝素钠复合物的方法学研究.pdf
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1、2666Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期tor gene cytosine,adenine,and guanine trinucleotide repeats in patients with endometriosis J.J Soc Gynecol Investig,2004,11:237-240.40 李大剑,周军,刘春丽,等.自拟痛经宁对气滞血瘀型原发性痛经血清性激素、前列腺素及钙、镁的影响J.中医药临床杂志,2012,24(10):949-952.41 金若敏
2、,陈兆善,陈长勋,等.益母草治疗痛经机制探索J.中国现代应用药学,2004,21(2):90-93.42 Simmons CF,Clancy TE,Quan R,et al.The oxytocin re-ceptor gene(OXTR)localizes to human chromosome 3p25 by fluorescence in situ hybridization and PCR analysis of somatic cell hybrids J.Genomics,1995,26:623-625.43 Akerlund M.Targeting the oxytocin re
3、ceptor to relax the myo-metrium J.Expert Opin Ther Targets,2006,10:423-427.44 Tasende C,Meikle A,Rodrguez-PM,et al.Estrogen and progesterone receptor content in the pituitary gland and uterus of progesterone-primed and gonadotropin releasing hormone-treat-ed anestrous ewes J.Theriogenology,2002,57:1
4、719-1731.45 夏良君,夏有兵.近 20 年针灸治疗卵巢早衰的临床研究及作用机制进展J.中国针灸,2018,38(5):565-570.46 李大剑,周军,刘春丽,等.自拟痛经宁对气滞血瘀型原发性痛经血清性激素、前列腺素及钙、镁的影响J.中医药临床杂志,2012,24(10):949-952.(收稿日期:2023-01-05;修回日期:2023-03-04)基于 Zeta电位表征血小板因子 4/依诺肝素钠复合物 的方法学研究赵婧雯1,欧阳艺兰1,钱玉兰2,刘志3,易琳1*,张真庆1*(1.苏州大学药学院,江苏苏州215006;2.苏州大学附属第一医院,江苏苏州215129;3.苏州二叶
5、制药有限公司,江苏苏州215002)摘要:目的建立 Zeta电位法研究血小板因子 4/依诺肝素钠(PF4/Eno)复合物表面电荷的方法,以比较和评价肝素类样品潜在的免疫原性。方法考察不同孵育时间、不同 PF4/Eno摩尔比例对 PF4/Eno 复合物表面电荷的影响,并对方法的精密度和专属性进行分析验证。结果孵育时间在 10 30 min时 PF4/Eno 复合物较为稳定;PF4/Eno复合物的 PHR 0值约为 12,PF4/Hp 复合物的 PHR 0值约为 48,差异有统计学意义(P 0.001),表明方法具有较好的专属性;日内精密度 RSD 8.0%,日间精密度 RSD 为 8.2%,表明
6、方法精密度良好。结论建立的方法可以用于比较和评价肝素类样品潜在的免疫原性,并为依诺肝素钠仿制药的免疫原性一致性评价提供理论和方法上的参考。关键词:肝素诱导的血小板减少症;血小板因子 4;依诺肝素钠;Zeta电位法中图分类号:R917,R94文献标识码:A文章编号:1672-2981(2023)10-2666-06doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2023.10.018Development of a Zeta potential method to characterize platelet factor 4-enoxaparin complexZHAO Jing-we
7、n1,OU-YANG Yi-lan1,QIAN Yu-lan2,LIU Zhi3,YI Lin1*,ZHANG Zhen-qing1*(1.College of Pharmaceutical Sciences,Soochow University,Suzhou Jiangsu 215006;2.The First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou Jiangsu 215129;3.Suzhou Erye Pharmaceutical Co.,Ltd,Suzhou Jiangsu 215002)Abstract:Objective
8、To develop a Zeta potential method to characterize the surface charge of platelet factor 4/enoxaparin(PF4/Eno)sodium complex,and to compare and evaluate the potential immunogenicity of heparin samples.Methods The effect of different incubation time and PF4/Eno 基金项目:江苏省研究生科研与实践创新计划项目(No.SJCX21_1357)。
9、作者简介:赵婧雯,女,硕士,主要从事肝素类药物的免疫原性研究,email:*通信作者:易琳,女,助理研究员,主要从事肝素类药物、天然多糖等糖类化合物的结构和活性研究,email:;张真庆,男,教授,主要从事糖药物研究,email:z_2667中南药学 2023 年 10 月 第 21 卷 第 10 期Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 肝素治疗中常伴有血小板减少症(heparin induced thrombocytopenia,HIT),HIT分为两种:一种是无免疫机制参与的 HIT-型,症状轻微,病程呈自限性1;另一种是 HIT
10、-型,是一种免疫反应,常伴有血栓发生2。临床上,HIT通常是指 HIT-型。HIT是肝素治疗过程中的严重并发症,据临床统计,肝素引发 HIT的发生率约为3%3-5,低分子量肝素(low molecular weight hepa-rin,LMWHs)引发 HIT的发生率约为0.2%。虽然肝素类药物引起的 HIT发生率并不高,但由 HIT引发的血栓概率却达 30%70%,HIT导致的截肢和死亡概率更是分别达 10%和 20%30%6-8,这些严重威胁患者的健康与生存。大量研究表明由肝素(heparin,Hp)、血小板因子 4(PF4)、它们的复合物(PF4/Hp)以及复合物的反应性抗体组成的超大
11、复合物(ultra large complex,ULC)是 诱 发 HIT 的 关 键9-12。血小板颗粒释放的 PF4 与 Hp有较强的结合能力,它们的复合物能够刺激免疫细胞释放 IgG 抗体,IgG 通过 Fab片段与 PF4/Hp 复合物特异性结合,形成 PF4/Hp/IgG三元复合物,即 HIT 抗体。HIT抗体通过 IgG上的 Fc片段,与血小板上的FcRIIa受体结合,进一步激发机体的免疫反应:一方面,激活的 Fc片段介导巨噬细胞的吞噬作用,使 HIT抗体连同血小板被巨噬细胞清除,引起血液中血小板减少;另一方面,激活血小板,使活化的血小板释放更多的凝血因子,并促使血小板聚集而形成动
12、静脉血栓,这种伴有凝血级联反应的免疫原性反应,称为肝素引起的血小板因子减少综合征,即 HIT 综合征13-18。LMWHs 是由未分级肝素经酶解、化学降解等方式制备的产品,不同的生产工艺产生不同种类的 LMWHs,如目前临床应用最广泛的依诺肝素钠(enoxaparin sodium,Eno)是肝素苄酯化后再碱解制备而来19。与 Hp相比,LMWHs具有出血不良反应小、生物利用度高、半衰期长、患者依从性好等优点8,20-21,在临床上 LMWHs 正在逐渐替代 Hp,成为治疗深度血栓等疾病的主要产品。LMWHs 具有更低的分子量,其引起的HIT 综合征发生率明显低于肝素,但鉴于 HIT引发血栓、
13、坏死等严重不良反应的风险,LMWHs的免疫原性评估依然是业界关注的重点22。2016 年,美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)将 LMWHs 免疫原性研究列入仿制药生产指导原则,即 Im-munogenicity Related Considerations for Low Mo-lecular Weight Heparin23;同年欧洲医药管理局(European Medicines Agency,EMC)同 样 强 调了 LMWHs 类免疫原性评估的必要性,并发表了相应的指导原则,即 Guideline on non-clinical
14、and clinical development of similar biological medicinal products containing low molecular-weight-hepa-rins24;2020 年国家药监局药品审评中心进一步规范了国内 LMWHs 类仿制药一致性评价过程中的免疫原性评估要求25。以上指导原则均将评估 PF4-LMWHs 复合物的表面电荷作为重要工作内容之一。带有强正电荷的蛋白 PF4 与带有强负电荷的 LMWHs 通过静电相互作用形成 PF4-LM-WHs 复合物,复合物表面强正电荷或强负电荷使复合物在溶液中稳定分散,而当复合物表面电荷表现出
15、减少或是呈中性状态时,复合物倾向于聚集26,因此评估 LMWHs 对 PF4 的电中和能力,即不同摩尔比下 PF4 与 LMWHs 形成复合物的表面电荷高低,对反映 LMWHs 潜在的免疫原性至关重要。溶液中颗粒表面的电荷会引起附近粒子不同程度的聚集,这种聚集会在粒子表面产生一定的电势,该电势可以通过测量颗粒-液体界面处的电位差来反映,实际工作中以测定体系的Zeta电位值来反映27-28,即 PF4 与 LMWHs 混合体系中,PF4-LMWHs 复合物总表面电荷可以通过测定体系的 Zeta电位反映。本文以 LMWHs 中应用最广泛的 Eno为研究molar ratios on the sur
16、face charge of PF4/Eno sodium complex was determined.The precision and specificity of the method were verified.Results The PF4/Eno was relatively stable within 10 30 min of incubation.The PHR 0 of PF4/Eno complex was about 12,and the PHR 0 of PF4/Hp complex was about 48,with a significant difference
17、(P 0.001),indicating good specificity of the method.The within-day precision RSD was less than 8.0%,and the inter-day precision RSD was 8.2%,demonstrating proper precision of the method.Conclusion This method can be used to compare and evaluate the potential immunogenicity of heparin samples,and pro
18、vide a theoretical and a methodological reference for the consistent evaluation of immunogenicity of enoxaparin sodium generics.Key words:heparin induced thrombocytopenia;platelet factor 4;enoxaparin sodium;Zeta potential method2668Central South Pharmacy.October 2023,Vol.21 No.10 中南药学 2023 年 10 月 第
19、21 卷 第 10 期对象,建立并验证 Zeta电位法表征 PF4/Eno复合物形成的情况,为 Eno仿制药的质量评价以及提升提供一定的参考。1材料Eno对照品(欧洲药典标准品,批号:6.0);Hp对照品(欧洲药典对照品,批号:2.0);Eno原研药(商品名:克赛,北京赛诺菲制药有限公司,规格:0.6 mL/6000 AxaIU,批号:8S313、9S14PA、AS184A);Eno仿制药(规格:0.6 mL/6000 AxaIU,批号:Y9200701、Y9200702、Y9200703,苏州二叶制药有限公司);重组人源 PF 4(批号:101543,纯度:98%,Sigma-Aldrich
20、公司);PBS缓冲液(包含 10 mmolL 1 Na2HPO4,1.75 mmolL 1 KH-2PO4,137 mmolL 1 NaCl,2.65 mmolL 1 KCl;pH 7.4;批号:B540626,上海生工生物工程股份有限公司);ELGA超纯水机(型号:PURELAB Option-S7/15,电阻率 18.2 Mcm,英国埃尔格公司);Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪(英国Malvern Panalytical公司)。2方法2.1样品的制备取 Eno对照品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释成 10.00 mgmL 1的储备液,用超纯水稀释摩尔浓度分别为 0.13
21、、0.25、0.50、1.00和 2.00 molL 1的溶液。PF4 用 PBS缓冲液配制成 128 molL 1的储备液;储备液用超纯水稀释至 4.00 molL 1,现配现用。2.2方法的建立与验证2.2.1Zeta电位测定使用 Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪,模型为 Smoluchowski模型,设定温度为 25,平衡时间为 120 s,样品池类型为 DTS1070。取 1 mL待测液,并以缓慢均匀的速度注入样品池,检查是否除去所有气泡,并用擦镜纸擦干溅在外部电极的液体,将样品池插入样品槽中检测。2.2.2孵育时间的考察取 4.00 molL 1 PF4溶液与 0.2
22、5 molL 1的 Eno 等体积混合均匀,室温条件下分别孵育 0、10、20、30、40、50、60 min后按“2.2.1”项下方法进行检测,每个孵育时间点设置 3 个平行实验。2.2.3PF4/Eno摩尔比的考察取 4.00 molL 1 PF4 溶液分别与不同浓度的 Eno溶液等体积混合均匀,使混合体系中 PF4/Eno的摩尔比分别321、161、81、41、21,室温条件下孵育 10 min后按“2.2.1”项下方法进行检测,每个比例下设置 3 个平行实验。2.2.4方法专属性考察取 Hp对照品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释成 10.00 mgmL 1储备液,用超纯水将该储备液分
23、别稀释成0.04、0.06、0.08、0.13和0.25 mol L1的溶液。取现配的4.00 molL 1 PF4 溶液分别与上述不同浓度的 Hp样品溶液等体积混合均匀,使 PF4/Hp摩尔比分别为961、641、481、321 和 161,并 于 室温条件下孵育 10 min后按“2.2.1”项下方法进行检测,每个比例设置 3 个平行实验。2.2.5方法精密度考察取 PF4/Eno的摩尔比为161,室温条件下孵育 10 min后按“2.2.1”项下方法进行检测,储备液配制当日、次日以及第 5日分别稀释 9 次后进行测定。2.3利用 Zeta电位法比较不同批次 Eno样品对PF4 电荷中和能
24、力取 Eno样品适量,精密称定,加水溶解并定量稀释成 10.00 mgmL 1的储备液,用超纯水分别稀释成 0.13、0.25、0.40、0.50 和 1.00 molL 1的 溶 液。取 现 配 的 4.00 molL 1 PF4 溶液分别与上述不同浓度的 Eno样品溶液等体积混合均匀,使 PF4/Eno摩尔比分别为 321、161、101、81 和 41,并于室温条件下孵育 10 min,按“2.2.1”项下进行检测,每个样品设置 3 个平行实验。2.4数据分析及统计分析采用的数据分析软件为 Zetasizer software version 7.11(Malvern,Worcester
25、shire,United Kingdom),统计评估软件为 Origin。将 PF4/Hp(PF4/Eno)样品复合物的 Zeta数据与其摩尔比例(PHR)的对数进行 S 型(Logistic)方程拟合得到 Sigmoidal回归曲线,根据 S 型方程计算复合物表面电荷为零时的摩尔比例(PHR 0)。3结果3.1方法的建立与验证3.1.1孵育时间的考察图 1 显示,混合体系的 Zeta电位随孵育时间延长有先增大后变小的趋势。混合体系的 Zeta电位在 10 30 min内呈现增加的趋势且整体大于 15 mV,其颗粒静电排斥力较大,复合物粒子稳定性较好,而过长的孵育时间导致复合物 Zeta电位下
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