槲皮素-3-O-葡萄糖苷抑制α-乳白蛋白非酶糖基化机制分析.pdf
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1、28 2023,Vol.44,No.20 食品科学 食品化学槲皮素-3-O-葡萄糖苷抑制-乳白蛋白 非酶糖基化机制分析张 露1,2,徐林菊1,彭春彦1,王佩欣1,谢作桦2,谢 星1,贾晓燕1,涂宗财1,3,*(1.江西师范大学生命科学学院,国家淡水鱼加工技术研发专业中心,江西 南昌 330022;2.江西德上制药股份有限公司,江西 樟树 331200;3.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047)摘 要:以牛-乳白蛋白(bovine-lactalbumin,-La)和果糖为非酶糖基化模型,分析槲皮素-3-O-葡萄糖苷(quercetin-3-O-D-glucuronid
2、e,Q3G)对-La非酶糖基化过程中果糖胺和5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)形成及游离氨基含量和褐变度的影响,然后结合分子对接和质谱鉴定技术进一步揭示其对非酶糖基化的抑制机理。结果表明:Q3G能显著减轻糖基化过程中的褐变程度,增加游离氨基含量,抑制果糖胺和5-HMF的形成,延缓糖基化反应的进程,且Q3G添加量为2 mmol/L时效果最好。分子对接结果表明Q3G可通过氢键、范德华力和疏水相互作用与-La的活性氨基酸残基进行结合,影响-La和果糖的糖基化反应,缓解糖基化反应的进程。同时,超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱串联质谱分析也发现Q3G屏蔽
3、了糖基化的潜在活性位点Lys93和Lys108,且新增糖基化位点Lys98的糖基化活性较弱,可达到抑制非酶糖基化的作用。本研究可为Q3G作为潜在抗糖基化剂的开发提供理论基础。关键词:槲皮素-3-O-葡萄糖苷;-乳白蛋白;分子对接;糖化位点鉴定;非酶糖基化Mechanism of Action of Quercetin-3-O-glucoside against the Non-enzymatic Glycosylation of-LactalbuminZHANG Lu1,2,XU Linju1,PENG Chunyan1,WANG Peixin1,XIE Zuohua2,XIE Xing1,J
4、IA Xiaoyan1,TU Zongcai1,3,*(1.National R&D Center for Freshwater Fish Processing,College of Life Sciences,Jiangxi Normal University,Nanchang 330022,China;2.Jiangxi Deshang Pharmaceutical Co.Ltd.,Zhangshu 331200,China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang
5、330047,China)Abstract:In this study,the effect of quercetin-3-O-D-glucuronide(Q3G)on the formation of fructosamine and 5-hydroxymethylfurfural(5-HMF),the amount of free amino groups and browning degree in a non-enzymatic glycosylation model consisting of bovine-lactalbumin(-La)and fructose were eval
6、uated.In addition,the inhibitory mechanism of Q3G against non-enzymatic glycosylation was explored by molecular docking and mass spectrometry(MS).The results indicated that Q3G could significantly reduce the browning degree,increase the free amino groups,inhibit the formation of fructosamine and 5-H
7、MF,and delay the process of glycosylation reaction.The effect was most pronounced at 2 mmol/L Q3G.Molecular docking analysis indicated that Q3G could bind with the active amino acid residues of-La through hydrogen bonds,van der Waals force and hydrophobic interactions,delaying the process of glycosy
8、lation reaction.Meanwhile,by ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-orbitrap tandem mass spectrometry (UPLC-Q-Orbitrap MS/MS)analysis,it was found that Q3G shielded the potential glycosylation sites Lys93 and Lys108,and the activity of the glycosylation site Lys98 was weak,indicatin
9、g inhibited non-enzymatic glycosylation reaction.This study can provide a theoretical basis for the development of Q3G as a potential anti-glycosylation agent.Keywords:quercetin-3-O-D-glucuronide;bovine-lactalbumin;molecular docking;identification of glycosylation sites;non-enzymatic glycosylationDO
10、I:10.7506/spkx1002-6630-20221004-027中图分类号:TS201.6 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)20-0028-07收稿日期:2022-10-04基金项目:国家自然科学基金地区科学基金项目(31860475);江西省自然科学基金面上项目(20212BAB205017)第一作者简介:张露(1987)(ORCID:0000-0003-0800-4762),女,教授,博士,研究方向为食品营养与健康。E-mail:*通信作者简介:涂宗财(1965)(ORCID:0000-0001-8877-4681),男,教授,博士,研究方向为食物资源开发与
11、高效利用。E-mail:Tuzc_食品化学 食品科学 2023,Vol.44,No.20 29引文格式:张露,徐林菊,彭春彦,等.槲皮素-3-O-葡萄糖苷抑制-乳白蛋白非酶糖基化机制分析J.食品科学,2023,44(20):28-34.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221004-027.http:/ ZHANG Lu,XU Linju,PENG Chunyan,et al.Mechanism of action of quercetin-3-O-glucoside against the non-enzymatic glycosylation of-lactalbum
12、inJ.Food Science,2023,44(20):28-34.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221004-027.http:/糖基化反应是普遍存在于食物加工储存过程中还原糖羰基和蛋白质游离氨基之间的羰氨缩合反应,会形成一系列含氮和含氧杂环的异质荧光产物,如5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,5-HMF)、丙烯酰胺、活性自由基和晚期糖基化产物(advanced glycosylation end products,AGEs)等1。研究发现一些糖基化产物会对细胞或人体产
13、生多种危害,如体内过多的5-HMF可促进肠道隐性病灶的发展2;食物中的丙烯酰胺摄入过多会加速细胞凋亡和促进炎症反应,其代谢产物环氧丙酰胺也会通过攻击DNA造成机体损伤3;AGEs在体内的积累会增加糖尿病、肾病、动脉粥样硬化等疾病的发生 概率4,因此,减缓非酶糖基化的反应进程和抑制有害糖基化产物的生成对提高食品安全,促进人体健康具有重要意义。目前,人工合成的糖基化抑制剂氨基胍对非酶糖基化具有较好抑制效果,但其毒副作用强,会引起胃肠功能紊乱、肝功能异常、贫血等症状,已被临床上禁止使用5。多酚是天然抗糖基化剂的优质来源,具有高效、低毒和副作用小等特点,是目前的研究热点。据报道,多酚可通过清除自由基、
14、影响蛋白质的空间结构、捕获甲基乙二醛等多种方式抑制糖基化过程以及糖基化产物的形成6。如:Wu Chihao等7发现槲皮素、山柰酚、异鼠李素和杨梅素可有效抑制卵清蛋白-果糖体系的糖基化反应,屏蔽卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的糖基化位点,减少5-HMF等有害产物的形成。Jia Li等8发现狭叶沙枣花提取物及其主要成分丁香苷可与OVA自发结合,改变OVA的构象,减少其与果糖的结合位点,表现出显著的糖基化抑制效果。槲皮素-3-O-葡萄糖苷(quercetin-3-O-D-glucuronide,Q3G)是槲皮素的同系化合物,由于其葡萄糖苷部分键的伸长使其生物利用度和安全性均优于芦丁及槲皮素9
15、。前期研究发现,Q3G通过与牛-乳白蛋白(bovine-lactalbumin,-La)相互作用,改变其构象,显著减少AGEs的形成,然而,其抑制机制尚不明确,需要进一步的探究10。本实验以-La-果糖为糖基化模型,以Q3G为抑制剂,通过检测褐变程度和游离氨基、果糖胺、5-HMF等的含量,并利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析糖化导致的-La交联,考察Q3G对非酶糖基化的抑制活性;然后,利用分子对接技术分析Q3G与-La之间的相互作用关系,并运用超高效液
16、相色谱-四极杆-静电场轨道离子阱串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-orbitrap tandem mass spectrometry,UPLC-Q-Orbitrap MS/MS)技术探究Q3G对-La糖基化位点的影响,旨在揭示Q3G对非酶糖基化的抑制机制。1 材料与方法1.1 材料与试剂Q3G、L-赖氨酸(L-lysine,Lys)上海源叶生物科技有限公司;氨基胍(aminoguanidine,AG)、尿素、二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)、碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA)美
17、国Bio-Rad公司;乙腈、甲醇、甲酸(均为色谱级)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;-La 美国Sigma公司;三氟乙酸、邻苯二甲醛(o-phthaladehyde,OPA)、胰蛋白酶、糖化血清蛋白检测试剂盒、果糖及其他试剂(均为分析级)北京索莱宝科技有限公司。1.2 仪器与设备Synergy H1多功能酶标仪 美国BioTek公司;1260液相色谱仪 美国Agilent Technologies Inc科技公司;UPLC-Q-Orbitrap MS/MS仪 美国Thermo Fisher公司。1.3 方法1.3.1 糖基化体系制备参照文献10方法构建-La糖基化体系。取1 mL 20 mg/
18、mL-La(pH 7.4,200 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS)含0.2%叠代钠)、1 mL 20 mg/mL果糖(溶于PBS)和100 L不同浓度样品于试管中混匀,55 反应24 h后快速冷却到室温,4 冰箱保存用于后续分析。以AG为阳性对照品,无水乙醇和PBS代替反应体系的Q3G和果糖为控制组和空白组。1.3.2 游离氨基测定参照刘俊等11的方法测定样品中游离氨基含量。取50 L适宜浓度样品与1 mL OPA混匀,避光反应2 min后,取200 L反应液于96 孔酶标板上,采用酶标仪测定其在340 nm波长处的吸光度,以PBS代替样
19、品为空白对照。配制00.8 mg/mL的Lys标准品溶液用于制作Lys30 2023,Vol.44,No.20 食品科学 食品化学标准曲线,获得标准曲线y1.630 4x0.132 3,R20.998 9。结果以Lys当量(mg/mL)表示。1.3.3 果糖胺含量测定采用糖化血清蛋白试剂盒测定样品中果糖胺的含量,详细方法参照试剂盒说明书。1.3.4 褐变程度测定参考Tu Zongcai等12的方法测定样品的褐变程度。取一定量5 倍稀释后的样品于96 孔酶标板上,采用酶标仪测定样品在294 nm波长处的褐变程度,以PBS代替样品作为空白对照。实验结果以A294 nm表示。1.3.5 5-HMF含
20、量的测定参照李军等13的方法测定样品中5-HMF的含量。取1 mL样品与100 L6 mol/L盐酸于试管中,沸水浴反应15 min,冷却至室温后,4 000 r/min离心20 min,收集上清液,过0.22 m滤膜,采用配备有Phenomenex C18柱(150 mm4.6 mm,5m)的UPLC仪进行定量分析。色谱条件如下:流动相:A为0.1%的甲酸溶液,B为纯甲醇;流速:0.6 mL/min;柱温:25;紫外检测波长:285 nm;进样量:10 L。采用30%B对样品等度洗脱20 min。配制1、2、2.5、5 g/mL和7.5 g/mL的标准品溶液用于制作5-HMF的标准曲线,获得
21、标准曲线 y129.85x330.94,R20.998。实验结果表示为g/mL。1.3.6 SDS-PAGE分析参照刘俊等11的方法进行SDS-PAGE分析。制备5%浓缩胶和12%分离胶,并调节样品蛋白质量浓度至1 mg/mL,将蛋白质溶液与样品缓冲液以3 1(V/V)的比例混合,沸水浴5 min。取10 L样品进行SDS-PAGE分析,再用考马斯亮蓝染色液染色0.5 h,脱色24 h,拍照分析。1.3.7 分子对接从蛋白质数据库(protein data bank,PDB)获取-La的3D结构(PDB编号:1F6S),从NCBI网站下载Q3G的三维结构(https:/pubchem.ncbi
22、.nlm.nih.gov/compound/5280804),再采用AutoDock Tools 1.5.6对-La和Q3G的结构进行优化处理,生成.pdb文件,用于后续分子对接。利用Discovery Studio 2017软件拟合配体与氨基酸残基之间的相互作用关系,参数如下:对接盒子中心坐标(X,Y,Z:46.76,99.312,12.307),盒子大小为60 60 60,格点间距0.375,对接次数设为100,采用拉马克遗传算法进行拟合,并选择具有最低结合能的构象作为模型用于后续分析。1.3.8 糖基化位点鉴定1.3.8.1 样品的水解参考Zhang Lu等14的方法,使用SDT缓冲液(
23、4%SDS、100 mmol/L Tris-HCl、1.0 mmol/L DTT,pH 7.4)、50 mmol/L IAA溶液(溶于UA缓冲液:8.0 mol/L尿素、150 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)和碳酸氢铵缓冲液(100 mmol/L,pH 8.5)对糖基化-La溶液进行变性、还原和烷基化处理。然后用胰蛋白酶在37 水解糖蛋白16 h,并用50%三氟乙酸溶液终止水解。最后将水解产物于14 000 r/min离心10 min,收集过滤的蛋白水解肽用于UPLC-Q-Orbitrap MS/MS分析。1.3.8.2 UPLC-Q-Orbitrap MS/MS分析采用300
24、0RSLCnano液相色谱系统对蛋白质水解肽进行分离。流动相A和流动相B分别为含0.1%甲酸的超纯水和含0.1%甲酸的乙腈组成。洗脱程序为:06 min,96%A、4%B;650 min,96%75%A、4%25%B;5058 min,75%60%A、25%40%B;5861 min,60%15%A、40%85%B;6166 min,15%A、85%B;6673 min,96%A、4%B。流速300 nL/min;进样量2.0 L。采用UPLC-Q-Orbitrap MS/MS获取肽段的MS和MS/MS数据。MS参数为:负离子模式,质量扫描范围:m/z 3001 800;裂解模式:电子转移解离
25、(electron transfer dissociation,ETD)和高能碰撞解离;MS分辨率:60 000;自动增益控制为:4105;最大注射时间:50 ms;归一化碰撞能量:30 eV。MS/MS参数:分辨率15 000;自动增益控制:4105;最大注射时间:50 ms;归一化碰撞能量:30 eV。1.4 数据分析所有实验重复3 次,采用IBM SPSS 25.0软件进行统计学分析,结果以 s表示。通过单因素方差分析评价样品之间的差异显著性(P0.05,差异显著);采用OriginPro 2017对数据进行作图(OriginLab Corp,USA)。2 结果与分析2.1 游离氨基含量
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