黄色瘤胃球菌双功能酶xynD基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征.pdf
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1、 南京农业大学学报():/.:./.收稿日期:基金项目:中央引导地方科技发展专项资金项目()新疆维吾尔现代农业产业技术体系()作者简介:王蕾博士研究生通信作者:陈勇教授主要研究方向为动物营养与饲料科学:.王蕾李文菁杨东林等.黄色瘤胃球菌双功能酶 基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征.南京农业大学学报():.():.黄色瘤胃球菌双功能酶 基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征王蕾李文菁杨东林陈勇(新疆农业大学动物科学学院新疆 乌鲁木齐)摘要:目目的的 黄色瘤胃球菌 基因编码葡聚糖酶和木聚糖酶 个独立的催化结构域 本研究在毕赤酵母中导入 基因表达蛋白并对其酶活性及酶学性质进行研究 方方法法 根据毕赤酵母
2、的密码子偏爱性对 基因优化(优化后的基因命名为)构建重组质粒 转化至毕赤酵母 通过筛选获得基因工程菌株 经诱导表达获得重组 再对其酶学性质进行初步研究 结结果果 的木聚糖酶与葡聚糖酶在 和 酶活性和比活性均达到最大值分别为.、.和 .、.的木聚糖酶活性在温度 、值为.时较稳定最适酶活性温度和 值分别为 和.对 甲基葡萄糖醛酸木聚糖、高黏度阿拉伯木聚糖和桦木木聚糖有良好的水解作用 的葡聚糖酶活性在温度 、值为.时较稳定最适酶活性温度和 值分别为 和.对大麦 葡聚糖有水解作用 双功能酶活性被、和激发和 使其酶活性几乎丧失 结结论论 木聚糖酶和葡聚糖酶的最适底物分别为 甲基葡萄糖醛酸木聚糖和大麦 葡
3、聚糖最适温度分别为 和 最适 值均为.关键词:黄色瘤胃球菌双功能酶毕赤酵母异源表达酶学性质中图分类号:.文献标志码:文章编号:()():.().:第 期王蕾等:黄色瘤胃球菌双功能酶 基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征酶制剂在饲料、食品、造纸、医药及生物能源等多领域具有广泛的应用从环境中筛选酶的基因资源一直都是该领域的研究热点 反刍动物瘤胃是高效降解植物纤维的“发酵罐”其中纤维降解菌及其产生的纤维素酶和半纤维素酶发挥着重要作用 瘤胃中的纤维素降解菌包括瘤胃球菌()、产琥珀酸丝状杆菌()、溶纤维丁酸弧菌()和梭菌()等 其中黄色瘤胃球菌()和白色瘤胃球菌()是瘤胃中主要的纤维降解菌 黄色瘤胃球菌可
4、编码糖苷水解酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶等多种酶通过产生木聚糖酶复合体、多种内切葡聚糖酶以及外切葡聚糖酶来降解纤维素 黄色瘤胃球菌甚至能降解那些通常难以降解的、坚韧的棉花纤维这说明黄色瘤胃球菌纤维素及半纤维素基因资源的独特性及其潜在的应用价值研究发现黄色瘤胃球菌 基因组共有 个糖苷水解酶基因分布在 个糖苷水解酶家族中黄色瘤胃球菌 基因组中共有 个开放阅读框()编码 木聚糖酶(.简称木聚糖酶)其中有 个 编码双功能木聚糖酶 另一黄色瘤胃球菌 至少有 个编码木聚糖酶的基因其中 和 编码双功能酶 基因编码的双功能酶由 个不同的木聚糖酶结构域组成并由 个非常规连接区连接 基因编码的双功能酶由 个木聚
5、糖酶和 个 葡聚糖酶(.简称葡聚糖酶)结构域组成 由于植物性饲料中含丰富的葡聚糖和木聚糖添加木聚糖酶与葡聚糖酶具有提高饲料的消化利用率、促进动物生长的作用 因此通过基因工程技术异源表达 基因生产重组木聚糖酶和葡聚糖酶具有开发利用价值 在大肠杆菌()中 基因的表达产物可降解燕麦木聚糖和地衣多糖不降解羧甲基纤维素其木聚糖酶和葡聚糖酶比活性分别为.和.如此低的酶活性限制了该木聚糖酶和葡聚糖酶的进一步应用与大肠杆菌表达系统相比酵母表达系统具有表达水平更高、培养简单、可分泌表达等优点还可以使重组蛋白适当折叠并以 作为信号肽酶分泌至细胞外 因此在毕赤酵母()中表达 基因有望获得更高的酶活性本研究在不改变氨
6、基酸序列的情况下对来源于黄色瘤胃球菌的双功能酶 基因进行密码子优化再在毕赤酵母中表达并对其酶学特征进行研究为重组工程菌应用到饲料工业中提供参考 材料与方法.菌株与试剂大肠杆菌、毕赤酵母 和表达载体 均为本课题组保存 聚合酶、限制性内切酶、和蛋白质标准分子质量购自宝生物工程(大连)有限公司质粒小提试剂盒和 纯化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司地衣多糖、大麦 葡聚糖、阿拉伯木聚糖购自 公司甲基葡萄糖醛酸木聚糖、燕麦木聚糖购自 公司其他试剂为国产分析纯 毕赤酵母 使用的培养基为酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基().主要仪器与设备 发酵罐和 型低温高速离心机(德国 生命科学公司)酶标仪(瑞士 集团公
7、司)型电转仪(美国 公司的 子公司)梯度 仪和 全自动凝胶成像系统(美国 公司)半自动部分收集器(美国 公司)水浴恒温振荡器(上海金怡医疗科技有限公司)气浴摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)型核酸蛋白仪(德国 公司)等.黄色瘤胃球菌双功能酶 基因的优化与合成根据黄色瘤胃球菌 基因序列(:.)使用 .在线分析基因的信号肽编码序列 为提高重组蛋白的表达水平去除 的信号肽编码区()以及催化模块间的连接序列()根据毕赤酵母密码子的偏爱性消除稀有密码子降低 二级结构自由能和调整 含量消除限制酶切位点在不改变氨基酸序列的情况下利用 对 基因进行密码子优化优化后的基因命名为 以进一步提高重组蛋白表达水平
8、将 序列送至 公司合成 合成的 和表达载体 经 /双酶切构建重组质粒 并转化至感受态大肠杆菌 经培养后采用碱裂解法提取重组质粒 经 和 双酶切初步鉴定后分别由 公司和 公司重复测序南 京 农 业 大 学 学 报第 卷.重组毕赤酵母工程菌的构建及筛选鉴定用限制性内切酶 将 线性化经琼脂糖凝胶电泳后纯化并回收电转化至毕赤酵母 感受态细胞 将电转后的细胞涂布于最小葡萄糖培养基()平板上 培养 挑选生长良好的菌落在 平板和最小甲醇培养基()平板上进行甲醇利用慢型()和甲醇利用正常型()表型的筛选再分别经、和 遗传霉素()的抗性筛选得到高拷贝阳性转化子 将得到的转化子进行 平板培养挑取单菌落液体培养 提
9、取重组酵母基因组 以序列()和()为引物(由 公司合成)采用 验证 基因是否插入.的逐级诱导表达及活性测定.的试管、摇瓶表达及酶活性的定性和定量测定 根据 的毕赤酵母 表达手册将抗 的 个转化子从缓冲复合甘油培养基()转接至 缓冲复合甲醇培养基()使菌悬液的 值为.进行试管甲醇诱导表达于 、水浴恒温振荡器中培养每 添加甲醇至终含量为.诱导表达 结束采集样品经低温高速离心机以 离心 后取上清液用于测定葡聚糖酶和木聚糖酶活性 从上述转化子中挑取酶活性最高的转化子在 摇瓶中扩大培养甲醇诱导 摇瓶表达为每瓶 培养基培养条件及样品的处理和测定与试管培养一致分别取摇瓶中诱导培养 和 的 和 以及分别诱导表
10、达、和 的 的培养上清液以高黏度阿拉伯木聚糖或大麦 葡聚糖为底物采用刚果红平板染色法定性检测 的酶活性 分别以高黏度阿拉伯木聚糖或大麦 葡聚糖为底物采用 法定量测定 的木聚糖酶和葡聚糖酶活性酶活性均测定 次 个木聚糖酶活性单位()是以 高黏度阿拉伯木聚糖为底物在.、条件下每分钟分解木聚糖生成 还原糖所需的酶量 个葡聚糖酶活性单位()是以 大麦葡聚糖为底物在.、条件下每分钟分解葡聚糖生成 还原糖所需的酶量.在发酵罐中的高密度发酵表达及纯化鉴定 将工程菌划线培养后挑取单克隆进行液体培养当菌液中菌浓度为 时取 菌液加入 培养基中培养 得到的菌液为种子液()在装有 培养基(、()、的发酵罐中接种 种子
11、液分别以甲醇或山梨醇/甲醇(体积比为)为碳源(单碳源和双碳源的添加量均为 持续添加)诱导表达 每 收集样品 离心后取上清液用于酶活性的测定和 及酶谱分析活性酶谱的凝胶配制与(分离胶及浓缩胶:双蒸水 丙烯酰胺.、.、.过硫酸铵 四甲基乙二胺)相同酶谱凝胶中分别加入 阿拉伯高黏度木聚糖和大麦低黏度葡聚糖酶液与未加二硫苏糖醇的上样缓冲液(、.溴酚蓝 甘油)(体积比)混匀上样电泳 取下凝胶置于洗涤液(、.、.)中洗涤 次每次 以去除凝胶中的 再置于孵育液(、.)中清洗 次每次 更换新的孵育液并将凝胶放入 和 中孵育 将凝胶使用 的刚果红染色 用 溶液脱色至出现清晰条带取发酵上清液经超滤浓缩后用葡聚糖凝
12、胶 层析选用长为 、直径为 的层析柱使用.磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液为洗脱液以部分收集器每 收集 管根据 值绘制吸收曲线 合并同一吸收峰的组分采用 法测定 各吸收峰的木聚糖酶和葡聚糖酶活性并进行.酶学特性测定.的最适 值及不同 值下的稳定性取纯化后的 与不同 值的缓冲液(.、.甘氨酸盐酸缓冲液 值.、.磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液 值.、.甘氨酸氢氧化钠缓冲液)适当稀释在 值 条件下分别于 和 反应 第 期王蕾等:黄色瘤胃球菌双功能酶 基因在毕赤酵母中的表达及其酶学特征 测定木聚糖酶和葡聚糖酶活性 每.个 值为 个间隔以酶活性最高为 以相对酶活性判断 的最适 值 在 值 条件下将 于 和 保持 后分别测
13、定剩余的木聚糖酶和葡聚糖酶活性以酶活性最高为 以相对酶活性判断 在不同 值下的稳定性.的最适温度及不同温度下的稳定性取纯化后的 分别在 条件下于.反应 测定其酶活性温度间隔为 以酶活性最高为 以相对酶活性判断 的最适温度 取 在上述温度条件下放置 后于.条件下测定剩余酶活性以酶活性最高为 以相对酶活性判断 在不同温度下的稳定性.的底物特异性 取纯化后的 以浓度为 (终浓度为.)的桦木木聚糖()、燕麦木聚糖()、甲基葡萄糖醛酸木聚糖()、高黏度阿拉伯木聚糖()和对硝基苯酚木糖苷()为底物参考上述方法在最适条件下测定木聚糖酶的最适底物以 的地衣多糖()、低黏度大麦 葡聚糖()、高黏度大麦 葡聚糖(
14、)和羧甲基纤维素()为底物在最适条件下测定葡聚糖酶的最适底物以酶活性最高为.金属离子、螯合剂和表面活性剂对 活性的影响测定 取 的双蒸水配制的含金属离子溶液(、()、)和乙二胺四乙酸()、十二烷基硫酸钠()、巯基乙醇()、二硫苏糖醇()(参与作用的金属离子及试剂的浓度均为 )与 酶液混匀后在室温下保持 在.、温度分别为 和 条件下测定木聚糖酶和葡聚糖酶活性以加入 双蒸水的酶活性(对照)为 计算各底物的相对酶活性.酶解反应的动力学参数测定 将酶液与不同质量浓度(、和 )和不同底物的溶液在最适条件下反应并测定酶活性使用 双倒数作图法计算 酶解反应的米氏方程并计算米氏常数()和最大反应速度()图 双
15、酶切重组质粒的鉴定 .标准品 .重组质粒 .经 和 双酶切的重组质粒 .图 重组酵母鉴定 .标 准 品 .基因组 .基因组 .重组毕赤酵母 .结果与分析.黄色瘤胃球菌 基因的密码子优化优化后的 基因经 测序基因全长 编码 个氨基酸残基理论相对分子质量为.优化前后 序列的一致性为.提交至 后获得的登录号为.重组酵母表达质粒的构建与鉴定从图 可以看出:重组质粒 经 和 双酶切电泳显示有 条 条带相对分子质量与预期相符初步说明 基因已插入到 从图 可以看出:提取、和 基因组 经 和电泳后 在 左右出现 条带此条南 京 农 业 大 学 学 报第 卷带为野生型乙醇氧化酶()基因扩增产物 有 条带分别在
16、和 左右分别为野生型 基因和 因子编码基因扩增产物 的 产物在 和 左右分别有 条带分别为野生型 基因和 因子及目的基因扩增产物表明目的基因 成功导入 基因组.的逐级诱导表达及酶活性.转化子的初筛 经筛选共得到抗 的 转化子 个 在试管中的木聚糖酶平均酶活性为.的葡聚糖酶平均酶活性为.其中 号转化子的木聚糖酶活性为.葡聚糖酶活性为.木聚糖酶活性是平均活性的.倍葡聚糖酶活性是平均活性的.倍 后续试验均选取 号转化子图 在试管表达下的酶活性 .在摇瓶中经甲醇诱导表达酶活性的定性测定 号转化子的 木聚糖酶经诱导 随诱导时间的延长酶活性逐渐增加在 的酶活性达到最大(.)之后随着时间的延长酶活性快速下降
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