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黄芩苷调节肠道菌群抑制高脂饮食诱导的结直肠癌肝转移研究.pdf
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1、 2023 年第 57 卷第10 期 Shanghai J Tradit Chin Med,Vol.57,No.10,Oct.2023 上海中医药杂志黄芩苷调节肠道菌群抑制高脂饮食诱导的结直肠癌肝转移研究魏娇,征宗梅,侯新新,贾丰菁,赵玲上海中医药大学中西医结合学院(上海 201203)【摘要】目的评估黄芩苷抑制结直肠癌肝转移的疗效并探讨其潜在的作用机制,为中医药防治结直肠癌转移提供科学依据。方法24只6周龄C57BL/6J雄性小鼠随机分为4组,每组6只,分别为正常饮食组、高脂饮食组、黄芩苷低剂量组(50 mg/kg,喂饲高脂饮食)和黄芩苷高剂量组(200 mg/kg,喂饲高脂饮食)。小鼠接受
2、正常或高脂饮食喂养4周后构建结直肠癌肝转移模型,术后给药干预4周。实验期间记录各组小鼠的体质量。实验结束后采血并检测总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平;称量腹股沟白色脂肪组织(iWAT)、附睾白色脂肪组织(eWAT)及背部棕色脂肪组织(BAT)的质量;记录原位肿瘤质量、肝脏质量、肝转移灶数量,计算肝脏指数(肝质量/体质量)和肝转移率;采用苏木精-伊红(HE)染色观察肝脏组织形态学变化;利用16S rRNA测序分析小鼠肠道菌群变化;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测小鼠肝转移灶中上皮间质转化(EMT)
3、标志物波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和闭合蛋白(Occludin)等相关基因mRNA的表达水平;采用皮尔森(Pearson)相关性分析方法检测肝转移灶中EMT基因表达水平与厚壁菌门细菌丰度的相关性。结果与正常饮食组比较,高脂饮食组小鼠体质量、血清TC和LDL-C水平、脂肪质量、原位肿瘤质量、肝质量、肝脏指数、肝转移灶数量及肝转移率明显增加,黄芩苷低、高剂量组上述指标均低于高脂饮食组,差异有统计学意义(P0.05)。高脂饮食组小鼠厚壁菌门丰度上升(P0.05),厚壁菌门/拟杆菌门比值增加(P0.05),经黄芩苷干预后,厚壁
4、菌门/拟杆菌门比值下降(P0.05)。与正常饮食组比较,高脂饮食组小鼠肝转移灶Vimentin和N-cadherin mRNA表达水平明显升高(P0.05),E-cadherin和Occludin mRNA表达水平明显降低(P0.05);与高脂饮食组比较,黄芩苷组小鼠肝转移灶Vimentin和N-cadherin mRNA表达水平明显降低(P0.05),E-cadherin和Occludin mRNA表达水平明显升高(P0.05)。厚壁菌门多种细菌相对丰度与 Vimentin 和 N-cadherin mRNA 表达水平呈正相关,但与 E-cadherin 和Occludin mRNA表达水平
5、呈负相关。结论黄芩苷可有效抑制高脂饮食诱导的结直肠癌肝转移,且与肠道菌群结构的恢复、上皮间质转化的逆转相关。【关键词】结直肠癌;肿瘤转移;黄芩苷;肠道菌群;小鼠模型;中药研究Baicalin modulates gut microbiota and inhibits liver metastasis of colorectal cancer induced by highfat dietWEI Jiao,ZHENG Zongmei,HOU Xinxin,JIA Fengjing,ZHAO LingSchool of Integrative Medicine,Shanghai Universit
6、y of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,ChinaAbstract:Objective To investigate the efficiency and underlying mechanism of baicalin in the treatment of colorectal cancer liver metastasis(CRLM)so as to provide a scientific foundation for the prevention and treatment of CRLM with traditional
7、Chinese medicine.MethodsTwenty-four C57BL/6J male mice aged 6 weeks were randomly divided into 4 groups:the normal diet group,the high-fat diet group,the low-dose baicalin group(50 mg/kg,fed with a high-fat diet)and the high-dose baicalin group(200 mg/kg,fed with a high-fat diet)with 6 mice in each
8、group.The liver metastasis of colorectal cancer model was established after the mice were fed with the normal or high-fat diet for 4 weeks.Subsequent to the surgery,the mice were orally gavaged with baicalin or PBS daily for 4 weeks.The body weights of the mice in each group were recorded during the
9、 experiment.At the end of the experiment,blood samples were collected for detecting the levels of total cholesterol(TC),total triglyceride(TG),low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C)and high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C).The mass of inguinal DOI:10.16305/j.1007-1334.2023.2304067实 验 研 究基金
10、项目 国家自然科学基金项目(82104955);上海市科委“科技创新行动计划”启明星项目(22QA1408700)作者简介 魏娇,女,硕士研究生,主要从事中西医结合防治肿瘤研究工作通信作者 赵玲,副研究员,硕士研究生导师;E-mail:59上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第10 期 Shanghai J Tradit Chin Med,Vol.57,No.10,Oct.2023 white adipose tissue(iWAT),epididymal white adipose tissue(eWAT)and dorsal brown adipose tissue(BAT)was w
11、eighed.Primary tumor weight,liver weight and the number of liver metastasis foci were recorded,and the liver index(the ratio of liver weight to body weight)and liver metastasis rate were calculated.HE staining was used to observe the morphological changes of the livers.The 16S rRNA gene sequence was
12、 used to analyze the structure and composition of the gut microbiota.The mRNA expression levels of epithelial mesenchymal transition(EMT)related genes including Vimentin、N-cadherin、E-cadherin,and Occludin were detected by RT-qPCR.The relationship between EMT related gene expression levels and Firmic
13、utes microbiota abundance was determined using Pearson correlation analysis.ResultsThe body weight,serum levels of TC and LDL-C,fat weight,primary tumor weight,liver weight,liver index,the number of liver metastases and liver metastases rate in the high-fat diet group were significantly higher than
14、those of mice in the normal diet group.The data of the low-dose and high-dose baicalin groups were lower than those of the high-fat diet group.All of the above differences were statistically significant(P0.05).Firmicutes abundance and the ratio of Firmicutes/Bacteroidetes(F/B)were increased(P0.05)in
15、 the high-fat diet group,and the F/B ratio decreased(P0.05)after baicalin treatment.Compared with the normal diet group,the mRNA expression levels of Vimentin and Ncadherin in liver metastases in the high-fat diet group were significantly increased(P0.05),while the mRNA expression levels of Ecadheri
16、n and Occludin were significantly decreased(P0.05);compared with the high-fat diet group,after intervention with baicalin,the mRNA expression levels of Vimentin and Ncadherin were significantly decreased(P0.05),while the mRNA expression levels of Ecadherin and Occludin were significantly increased(P
17、0.05).The relative abundances of several Firmicutes bacteria were positively correlated with the expression levels of Vimentin and Ncadherin mRNA,but negatively correlated with the expression levels of Ecadherin and Occludin mRNA levels.ConclusionBaicalin effectively inhibits high-fat diet-induced c
18、olorectal cancer liver metastasis,which is associated with the restoration of gut microbiota structure and the reversal of EMT.Keywords:colorectal cancer;tumor metastasis;baicalin;gut microbiota;mice model;traditional Chinese herbal medicine research结直肠癌(colorectal cancer,CRC)在恶性肿瘤中发病率高居第3位,并呈上升趋势,是
19、癌症相关死亡的主要原因之一1。远处转移是 CRC 患者的主要死亡原因,肝脏是其最常见的转移部位2。流行病学研究3显示,高脂饮食是影响结直肠癌发生发展的高危环境因素,其可通过诱发肠道菌群紊乱促进结直肠癌肝转移(colorectal cancer liver metastasis,CRLM)4。黄芩苷是黄芩中具有生物活性的黄酮类化合物。现代研究5表明,黄芩苷具有抗癌、抗炎、抗氧化、降血脂和促凋亡等多种药理活性。黄芩苷还可通过多种途径调节“肠-肝轴”,重塑肠道菌群,在疾病预防和治疗中发挥重要作用6。目前,尚无关于黄芩苷抑制CRLM的作用及机制报道。因此,本研究拟采用高脂饮食诱导 CRLM,并在此基础
20、上评估黄芩苷抗肿瘤转移的疗效,明确黄芩苷对肠道菌群组成的影响,初步探讨其抗肝转移的机制,进而为结直肠癌的中医药防治提供实验依据。1材料与方法1.1材料1.1.1动物6周龄C57BL/6J小鼠25只,SPF级,雄性,体质量 1822 g,购自上海吉辉实验动物饲养有限公司。动物生产许可证号:SCXK(沪)2017-0012。动物使用许可证号:XYXK(沪)2020-0009。实验小鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心,饲养室温度为 2024,湿度为50%70%,维持 12 h光照/12 h黑暗的昼夜节律,自由获取食物和水。本实验经上海中医药大学实验动物伦理委员会批准(伦理批准号:PZSHUTCM 2
21、01030020)。1.1.2细胞小鼠结肠癌细胞株MC38,购于宁波明舟生物科技有限公司。1.1.3主要药物与试剂黄芩苷,上海阿拉丁生化科技股份有限公司(批号:B110211);杜氏改良 Eagle(DMEM)培养基,源培生物科技股份有限公司(批号:L110KJ);胎牛血清,美国 Gibico 公司(批号:10099-141);苏木精-伊红(HE)染色试剂盒,索莱宝科技有限公司(批号:G1120);总胆固醇(TC)测试盒、三酰甘油(TG)测试盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测试盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测试盒,南京建成生物工程研究所有限公司(批号:A111-1-1、A110-1-
22、1、A113-1-1、A112-1-1);粪 便 DNA 基 因 组 提 取 试 剂 盒(QIAamp DNA Stool Mini Kit),德国 Qiagen 公司(批号:51504);TRIzol,碧云天生物技术有限公司(批号:R0016);预混液形式的两步法实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)试剂(去基因组)HiScriptQRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper),诺唯赞生物科技有限公司(批号:R223-01);高灵敏性染料法定量PCR检测试剂盒ChamQTM SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed),诺唯
23、赞生物科技有限公司(批号:Q341-02);甘 油 醛-3-磷 酸 脱 氢 酶(GAPDH)、波 形 蛋 白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和闭合蛋白(Occludin)基因的扩增引物由上海生工生物工程技术服务公司合成(批号:1528649218)。高脂饲料配比:蛋白质20%,糖类20%,脂肪60%;由帆泊生物技术有限公司提供(批号:FB-D12492)。普通饲料配比:蛋白质20%,糖类70%,脂肪10%;60上海中医药杂志 2023 年第 57 卷第10 期 Shanghai J Tradit Chin Med,Vol.57,N
24、o.10,Oct.2023 由上海中医药大学实验动物中心提供。1.1.4主要仪器电子分析天平,美国Ohaus公司(型号:PR423ZH/E);CO2恒温培养箱,美国 Thermo Fisher Scientific 公司(型号:BB150);多功能酶标仪,瑞士Tecan公司(型号:Spark);全自动密封式组织脱水机,美 国 Thermo Fisher Scientific 公 司(型 号:Shandon Excelsior);组织包埋机,美国Thermo Fisher Scientific公司(型号:Shandon Histostar);病理切片扫描仪,德国Precipoint公司(型号:M
25、8);实时荧光定量PCR仪,美国Thermo Fisher Scientific公司(型号:AB StepOne);台式高速低温离心机,德国Eppendorf公司(型号:5810R)。1.2分组与造模本实验共使用25只C57BL/6J小鼠,其中1只作为供瘤鼠,使用正常饮食饲喂。其余24只小鼠随机分为4组,每组6只,分别为正常饮食组、高脂饮食组、黄芩苷低剂量组和黄芩苷高剂量组。24只小鼠接受正常饮食或高脂饮食喂养4周后,参照文献7方法,构建结直肠癌原位肝转移模型。将100 L(1106个)处于对数生长期的MC38细胞接种于供瘤鼠腋下,待皮下移植瘤直径为1.01.2 cm时,采用气麻机麻醉供瘤鼠,
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