基于circRNA调控网络探讨七氟烷致老年小鼠认知功能障碍的分子机制研究.pdf
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1、论著(收稿日期:2 0 2 2-0 9-0 3)538脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第9 期epilepticus J.J Neurol,2022,269(7):3752-3760.17Li Z,Xin Z.Expression and significance of S-100,CysC and NF-k B in patients with acute cerebral infarction JJ.Exp Ther Med,2021,21(2):149.18Yuan Q,Yu L,Wang F.Efficacy of using thromboelastography todet
2、ect coagulation function and platelet function in patients withacute cerebral infarction J.Acta Neurol Belg,2021,121(6):1661-1667.19Nayak MK,Ghatge M,Flora GD,et al.The metabolic enzymepyruvate kinase M2 regulates platelet function and arterial thrombosisJ.Blood,2021,137(12):16581668.基于circRNA调控网络探讨
3、七氟烷致老年小鼠认知功能障碍的分子机制研究郑育秀刘丽丽黄泽波王涛刘莉芳【摘要】目的基于circRNA调控网络探究circ_0014063在七氟烷致老年小鼠认知功能障碍中的作用及其相关机制。方法circRNA-seq检测七氟烷麻醉和未处理老年小鼠海马组织,根据关键差异circRNA绘制ceRNA调控网络,并对靶基因进行KEGG分析。将30 只老年C57/BL6小鼠随机分为:对照组、模型组和治疗组,每组10 只。模型组和治疗组使用七氟烷麻醉,治疗组尾静脉注射si-circ_0014063,对照组和模型组注射si-NC。水迷宫实验比较各组小鼠认知功能差异,qRT-PCR检测各组小鼠circ_0014
4、063、miR-744-3p、A p o e 基因表达,westernblot检测各组小鼠Caspase3、Bc l-2 蛋白表达,ELISA检测各组小鼠淀粉样蛋白(A)、淀粉样物质前体蛋白(APP)、IL-1、T NF-含量,并通过spearman法分析circ_0014063与A、A PP、IL-1、T NF-的相关性。结果与未处理组比较,七氟烷麻醉组有2 38个circRNA表达降低,2 41个circRNA表达升高,其中circ_0014063和circ_0032434表达显著升高(P0.05)。circRNA调控网络预测circ_0014063靶向4个miRNA,18 个mRNA,c
5、 i r c RNA _0 0 32 434靶向4个miRNA,16个mRNA。K EG G 分析circ_0014063靶基因参与阿尔茨海默病(AD)、坏死性凋亡等通路。与对照组比较,模型组小鼠逃脱时间增加,穿台次数降低(P0.05),海马组织circ_0014063、A p o e、Ca s p a s e 3表达升高(P0.05),mi R-7 44-3p、Bc l-2 表达降低(P0.05),A、A PP、IL-1、T NF-含量升高(P0.05)。与模型组比较,治疗组小鼠逃脱时间减少,穿台次数升高(P0.05),海马组织circ_0014063、A p o e、Ca s p a s
6、e 3表达降低(P0.05),mi R-7 44-3p、Bc l-2 表达升高(P0.05),A、APP、IL-1、T NF-含量降低(P0.05)。c i r c _0 0 140 6 3表达与A、A PP、IL-1、T NF-含量呈正相关。结论七氟烷可导致老年小鼠认知功能损伤,circRNA调控网络在其中发挥重要作用。七氟烷可能通过调控circ_0014063/miR-744-3p/Apoe信号轴介导海马组织调亡,最终诱发老年小鼠认知功能障碍。【关键词】王环状RNA调控网络;七氟烷;认知功能障碍;老年小鼠中图分类号:R741.02文献标识码:A文章编号:10 0 6-351X(2 0 2
7、3)0 9-0 538-0 7To explore the molecular mechanism of sevoflurane induced cognitive dysfunction in elderly mice based oncircRNAregulatorynetworkZheng Yuxiu,Liu Lili,Huang Zebo,Wang Tao,Liu LifangDepartment of Anesthesiology,the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College,Haikou 570311,ChinaC
8、orresponding author:Zheng Yuxiu,Email:基金项目:海南省卫生健康行业科研项目(2 1A200267)作者单位:57 0 311海口,海南医学院第二附属医院麻醉科539脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第9 期Abstract Objective Based on the circRNA regulatory network,the role of circ_0014063 in sevofluraneinduced cognitive dysfunction in elderly mice and its related mechanisms were
9、 explored.Methods circRNA-seq wasused to detect hippocamal tissues of sevoflurane anesthetized and untreated aged mice.The ceRNA regulatory networkwas mapped according to the key differences of circRNA,and the target genes were analyzed by KEGG.Thirty agedC57/BL6 mice were randomly divided into cont
10、rol group,model group and treatment group,with 10 mice in each group.The model group and the treatment group were anesthetized with sevoflurane,si-circ_0014063 was injected into thetail vein of the treatment group,si-NC was injected into the control group and the model group.Water maze test wasperfo
11、rmed to compare the dfferences in cognitive function of mice in each group.The expressions of circ_0014063,mir-744-3p and Apoe genes were detected by qRT-PCR,and the expressions of Caspase3 and Bcl-2 proteins weredetected by Western blot.The contents of amyloid beta(A),amyloid precursor protein(APP)
12、,IL-1 and TNF-were detected by ELISA,and the correlation between circ_0014063 and A,APP,IL-1 and TNF-was analyzedby spearman method.Results Compared with the untreated group,238 circRNA expressions were decreased and 241circRNA expressions were increased in sevoflurane anesthesia group,among which c
13、irc_0014063 and circ_0032434expressions were significantly increased(P 0.05).The circRNA regulatory network predicted that circ_0014063would target 4 miRNAs and 18 mRNAs,and circRNA_0032434 would target 4 miRNAs and 16 mRNAs.KEGGanalysis of circ_0014063 target gene involved in Alzheimers disease(AD)
14、,necrotic apoptosis and other pathways.Compared with the control group,the escape time of model group was increased and the number of times of platformcrossing was decreased(P 0.05),the expressions of circ_0014063,Apoe and Caspase3 in hippocampus wereincreased(P 0.05),and the expressions of miR-744-
15、3p and Bcl-2 were decreased(P 0.05).The contents of A ,APP,IL-1 and TNF-were increased(P 0.05).Compared with the model group,the escape time of mice in thetreatment group was reduced,the number of times of platform crossing was increased(P 0.05),the expressions of circ_0014063,Apoe and Caspase3 in t
16、he hippocampus were decreased(P 0.05),and the expressions of miR-744-3p andBcl-2 were increased(P0.05).The contents of A,APP,IL-1 and TNF-decreased(P 0.05).The expressionof circ_0014063 was positively correlated with A,APP,IL-1 and TNF-.Conclusion Sevoflurane can causecognitive impairment in elderly
17、 mice,while the circRNA regulatory network plays an important role in.Sevofluranemay mediate hippocampal apoptosis by regulating circ_0014063/miR-744-3p/Apoe signal axis,and ultimately inducecognitive dysfunction in elderly mice.Key wordscircRNA regulatory network;Sevoflurane;Cognitive dysfunction;E
18、lderly mice非编码RNA(noncodingRNA,ncRNA)已成为几乎所有生物基因表达的关键调节因子,其中环状RNA(c i r c u l a r RNA,c i r c RNA)是由多个外显子反向剪接形成且没有5 和3 末端的ncRNA分子,在真核细胞中含量丰富-2 。越来越多的证据表明,circRNA在中枢神经系统疾病中发挥着重要作用,有望成为新的治疗靶点3。此外,circRNA可经过微泡或外泌体分泌到血液循环中,并且比线性RNA更稳定,因此可作为神经性疾病的潜在生物标志物。本实验基于内源竞争RNA(competing endogenousRNA,c e RNA)调控网络探
19、讨老龄大鼠七氟烷麻醉致认知功能障碍的分子机制,观察七氟烷麻醉对老年小鼠神经认知功能的影响并观察海马组织的病理形态学变化,使用circRNA技术筛选差异表达的circRNA,构建ceRNA调控网络,并考察circRNA差异表达对七氟烷麻醉致老年小鼠认知功能障碍的影响,明确ceRNA网络在老龄小鼠七氟烷麻醉致认知功能障碍的分子机制,最终从新的角度阐明七氟烷麻醉致认知功能障碍的发病机制,以期为临床的防治研究提供一定的参考思路。材料与方法1.实验动物雄性SPF级C57BL/6J小鼠30 只(2 1月龄,体质量50 55g),购自海南药物研究所有限责任公司,实验动物生产许可证号SCXK(琼)2 0 2
20、0-0 0 0 7。所有小鼠处于室温2 5,自然光暗周期的环境中饲养,实验期间自由饮食饮水。本研究动物方案经本院伦理委员会审核通过,所有动物操作均符合实验动物使用和保护条例。2.主要试剂与仪器七氟烷(150 412)购自江苏恒瑞医药股份有限公540脑与神经疾病杂志2 0 2 3年第31卷第9 期司生产;阴性对照(small interfering-negative control,si-NC)、小干扰环状 RNA 0014063(s ma l l i n t e r f e r i n g-negative control,si-circ_0014063)、Li p o f e c t a m
21、i n e T M2000购自美国Invitrogen公司;总RNA抽提试剂(t o t a l RNA e x t r a c t i o n r e a g e n t,T RIz o l)、逆转录试剂盒和SYBRGreen试剂购自湖南艾科瑞生物工程有限公司;细胞凋亡相关半胱氨酸肽酶(apoptosis-relatedcysteine peptidase,Ca s p a s e 3)抗体购自美国cellsignaling technology公司;B淋巴细胞瘤-2 基因(B-celllymphoma-2,Bc l-2)抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-pho
22、sphate dehydrogenase,GAPDH)抗体购自英国abcam公司;circ_0014063、m i R-7 44-3p和年龄及载脂蛋白基因E(age and apolipoprotein E,ApoE)的qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;Morris水迷宫(BD001)购自德国Grager公司;VarioskanLUX多功能酶标仪购自赛默飞世尔科技有限公司;AppliedBiosystems7500型荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。3.circRNA测序及差异表达基因筛选各组处死后,收集新鲜海马组织,用RNase-free配制的PBS缓冲液清洗。将样品分成体积0.
23、5cm3的小块,用Trizol试剂提取总RNA,构建链cDNA文库。质量检测合格后,使用IlluminaNovaseqTM6000进行测序。根据circRNA的结构特征和剪接序列特征,使用CIRCExploter2和CIRI软件对circRNA进行预测,根据circRNA的起始位置和结束位置整合两个软件的结果。测序结束后,使用Tophat 2进行序列比对,使用cuffLinks对所有基因进行量化,包括编码RNA和非编码RNA。然后用EdgeR包进行差异基因分析。有生物学重复的同时满足Log2差值倍数绝对值1和P0.05为差异基因。4.生物信息学技术利用TargetScan数据库(https:/
24、www.targetscan.org/vert_80/)和LncRNA2Target(h t t p:/w w w.lncrna2target.org/index.jsp)数据库预测circ_0014063的靶基因。使用KECG数据库(https:/www.kegg.jp/)对靶基因进行富集通路分析。最终结果通过Cytoscape软件进行作图。5.动物造模、分组与给药将30 只老年C57/BL6小鼠采用随机数字表法分为:对照组、模型组和治疗组,每组10 只。模型组和治疗组小鼠连续3d吸人3%七氟烷2 h,治疗组于每次吸七氟烷前1h治疗组小鼠尾静脉注射si-circ_0014063(5n m o
25、 l 溶于1mL生理盐水中),模型组小鼠尾静脉注射等体积si-NC。对照组不实施七氟烷麻醉,正常吸氧。吸人麻醉过程中应用多功能监护仪监测七氟烷浓度,通过红外线加热仪保持小鼠体温并于小鼠正反射恢复后放回鼠笼。使用TRIzol法提取各组细胞中的总RNA。使用酶标仪检测总RNA的纯度和含量。按照qRT-PCR试剂盒实验说明,依次进行逆转录和qRT-PCR实验。qRT-PCR反应条件:9 5(30 s)预变性后,变性95(7 s),退火55(30 s),7 2(15s),40 个循环周期。circ_0014063的引物序列:正向5-GGAAGTGAAGACAATAACAAGT-3,反向5-TCATTT
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