基因工程重组大肠杆菌发酵生物量产出的影响因素评估.pdf
《基因工程重组大肠杆菌发酵生物量产出的影响因素评估.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《基因工程重组大肠杆菌发酵生物量产出的影响因素评估.pdf(6页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、462 中国医药生物技术 2023 年 10 月第 18 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol,October 2023,Vol.18,No.5 DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2023.05.012 技术与方法 基因工程重组大肠杆菌 发酵生物量产出的影响因素评估 郑婷婷,田竣元,黄娟,吴鸿雪,蔡映芸,吴玉水 大肠杆菌因为生长速度快,易于培养,代谢可塑性强,拥有丰富的遗传和基因工程工具,成为代谢工程和合成生 物学的最佳宿主之一1。利用重组大肠杆菌的高密度发酵,可以获得较高的生物量和显著提高目的基因表达产物的浓度2。但在工业发酵过程中,影响生物量产出的因
2、素非常多,比如培养基的成分(细菌生长所需的营养物质)、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧浓度、培养温度、发酵液的 pH 值、补料方式以及发酵液流变学特性等3。近几年国内有关大肠杆菌高密度培养的文献报道表明,发酵 32 h 内的菌体密度大概在 OD600 为 79 1254-6。在构建重组大肠杆菌进行高密度发酵生产目的蛋白时,适宜的发酵种龄能缩短发酵的周期7,为后期工业化的生产奠定基础。微量元素的添加有利于发酵8,测试三氯化铁六水合物物料投入对发酵生物量产出是否有着差异,选择合适的供应商有利于后续发酵的工业化生产。大肠杆菌高密度培养过程,葡萄糖是碳源中最易利用的糖,但很容易产生乙酸并在超过一定浓度
3、之后影响生长和表达9。所以在发酵过程中,进行补料流加时,要时刻监测发酵罐中的残糖量,将其控制在一定水平10。本文应用比浊法11,在适宜重组大肠杆菌的发酵条件下测定发酵生物量,探究种龄、微量元素、残糖含量对重组大肠杆菌菌株 pET(UB41-Smoc)/BL21(DE3)的发酵生物量的影响。评估重组大肠杆菌高密度发酵生物量产出的影响因素,有利于提高发酵工艺水平以及重组目的蛋白的产出量,为实现重组菌发酵的工业化生产奠定基础。1 材料与方法 1.1 材料及仪器 NVT6200ZH 电子天平购自奥豪斯国际贸易(上海)有限公司;涡旋振荡仪、磁力搅拌器和迷你型离心机购自美国精骐有限公司;A2S-20-CE
4、-T 超纯水机购自美国艾科浦公司;台式高速冷冻离心机和超大容量冷冻离心机购自长沙湘智离心机仪器有限公司;LDZM-80L-II 立式压力蒸汽灭菌锅购自上海申安医疗器械厂;BLBIO-7GJ 发酵罐购自上海百仑生物科技有限公司;IS-A 叠加式恒温振荡器购自苏州捷美电子有限公司;721G 紫外-可见分光光度计购自上海仪电;GA-3 血糖仪购自三诺生物传感股份有限公司。重组大肠杆菌菌株 pET(UB41-Smoc)/BL21(DE3)由福建基诺厚普生物科技有限公司构建并保存,表达产品为一种生物类似药(产品代码 Smoc);三氯化铁六水合物分别为安徽 A 公司以及南京 B 公司产品。1.2 方法 1
5、.2.1 各种培养基与料液的配制 摇瓶 TB 培养基(g/L):磷酸氢二钾 12.5,磷酸二氢钾 2.3,大豆蛋白 胨 12,酵母浸粉 24,20%葡萄糖 10,灭菌后补加 1 ml 的 50 mg/ml 硫酸卡那霉素溶液。发酵盐类配方(g/L):一水柠檬酸 30,磷酸氢二钠 94.3,硫酸铵 40,磷酸二氢钾 80,无水葡萄糖 100。100 微量元素浓缩液(g/L):四水合二氯化锰 1.5,三氯化铁六水合物 30,二水氯化钙 5.36,氯化锌 6.75,硫酸铜 3.0,硼酸 0.69,氯化钴六水合物 1.14,钼酸钠 0.3。发酵培养基(g/L):酵母浸粉 30,灭菌后补加槽体盐类配方 1
6、00,50 mg/ml 硫酸卡那霉素溶液 1,消泡剂 0.1,50%七水硫酸镁溶液 2,100 微量元素浓缩液 10。发酵罐补料(g/L):无水葡萄糖 500,灭菌后补加 20%盐酸硫胺溶液 10,50%硫酸镁溶液 21,16%硫酸铵溶 液 50,100 微量元素浓缩液 10。以上各种培养基采用立式压力蒸汽灭菌锅 121 高温灭菌 30 min。1.2.2 生物量测定 采用操作简单、误差概率低的比浊法进行检测。用紫外-可见分光光度计测量 OD600 值,用 OD600 值表示样品菌液浓度。接菌前的发酵培养基作为空白溶液调节透光度 T=100%。将发酵培养液作适当倍数稀释后,使其在紫外-可见分光
7、光度计波长 600 nm 处测得的吸光度值在 0.1 1.0 内(较好的检测线性范围)。将测量值与稀释倍数相乘即为菌体密度 OD600 值。1.2.3 残糖测定 将发酵培养液作适当倍数稀释后,以 10 l 的进液量在血糖仪上检测。将测量值乘以稀释倍数即为发酵槽体中的残糖量(血糖仪检测单位为 mmol/L,依据 2 g/L=11.2 mmol/L 换算)。1.2.4 种龄对发酵生物量产出的影响 高压灭菌:50%硫酸镁溶液、20%葡萄糖溶液、摇瓶 TB 培养基、发酵培养基、发酵罐补料进行 121 高温灭 作者单位:351100 莆田,福建基诺厚普生物科技有限公司 通信作者:吴玉水,Email: 收
8、稿日期:2023-02-27 中国医药生物技术 2023 年 10 月第 18 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol,October 2023,Vol.18,No.5 463 菌 30 min。采用 0.22 m 滤膜除菌过滤发酵盐类配方:盐酸硫胺溶液、硫酸铵溶液、50 mg/ml 硫酸卡那霉素溶液、1 mmol/L IPTG 溶液、100 微量元素浓缩液。种子液制备:从 80 冰箱中取出菌种在生物安全柜中接入装有 TB 液体培养基的具挡板摇瓶中。于恒温振荡器中 37、150 r/min 条件下培养 15 h。进行 3 瓶摇瓶平行实验,菌体明显增长后,每小时取样一次,测量并记录
9、 OD600 值与 pH 值,监测菌体生长情况并绘制生长曲线。设置两组不同种龄的菌体进行发酵罐 培养。发酵罐培养:种子液以 4%的接种量接种于装有 2.7 L 初始发酵培养基的 7 L 发酵罐中培养。系统控制发酵罐恒温 37,通过调节搅拌转速和空气流速使溶氧百分数不低于 40。通过系统自动流加氨水,维持培养体系 pH 值在 7.0 左右。当菌体量快速增长,发酵培养基中的葡萄糖无法满足菌体生长需要时,变指数-恒 pH 流加补料12。通过每小时取样检测菌体量与残糖含量,反馈调节补料速度控制发酵液中残糖含量在较低水平。在菌体生长中后期降温至 25,加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L 进行诱
10、导。此时的菌体生长速度减慢,相应的降低补料速度。菌体收集:当一段时间内的菌体量不再增加,停止发酵。收集发酵液用超大容量冷冻离心机进行离心,弃去上清液后保存在 80 冰箱中。1.2.5 微量元素差异对发酵生物量产出的影响 高压灭菌、发酵罐培养以及菌体收集等方法同 1.2.4。种子液制备中,选择培养时间 6 h。选择安徽 A 公司吸潮和干燥批次以及南京 B 公司的三氯化铁六水合物配制发酵培养基所需的 100 微量元素浓缩液,分别加入发酵罐培养。1.2.6 发酵液残糖含量对发酵生物量产出的影响 高压灭菌和菌体收集等方法同 1.2.4。种子液制备中,选择培养时间 6 h。接种入发酵罐发酵培养 9 h,
11、OD600 值达到 60 左右。进行降温 IPTG 诱导后,根据残糖的含量和菌体量,控制补料的流加速度。调节控制一组发酵罐发酵液的残糖含量处于低水平(11.2 mmol/L),另一组发酵罐发酵液的残糖含量处于高水平(11.2 mmol/L)13。2 结果 2.1 种龄与菌体浓度的影响 进行 3 组摇瓶培养 15 h,3 h 后每小时取样测定菌体 生长浓度并绘制生长曲线(图 1)。从生长曲线可见,培养 3 5 h 菌体生长快速,属于对数生长期。培养 5 h 的 OD600 值均达到 3.0 左右。第 6 个小时开始,到培养结束阶段的生长速度减慢。故选择相同菌种分别摇瓶活化培养 6 h 与 12
12、h 后接入发酵罐进行发酵培养,每小时取样测量 OD600 值,进行菌体生长情况监测,绘制生长曲线。菌体摇瓶活化培养 12 h,接菌时菌体浓度 OD600 值为 3.8,菌体摇瓶活化培养 6 h,接菌时菌体浓度 OD600 值为 3.1。将此不同种子液接入发酵罐培养,所测菌体生物量产出有明显差异。第 2 和 3 小时时,种龄为 6 h 的发酵生物量产出几乎是种龄为 12 h 的两倍。第 3 小时以后的生物量产出仍存在差距,但差距在减小。到 9 h,种龄为 12 h 的发酵 OD600 值达到 55.8,种龄为 6 h 的重组大肠杆菌发酵 OD600 值达到 64.4,差异较大。进行降温 IPTG
13、 诱导后,两发酵罐均培养 29 h,种龄为 12 h 的发酵收菌 OD600 值为 137.6,种龄为 6 h 的发酵收菌 OD600 值达到 161.8,差异较大(图 2)。2.2 微量元素差异的影响 为测试发生吸潮现象的三氯化铁六水合物对重组大肠杆菌发酵生物量的产出是否有影响,选择安徽 A 公司从外观性状上观测发生吸潮现象的 2021 年批次三氯化铁六水合物和 2022 年批次的干燥三氯化铁六水合物。将这两批次的三氯化铁六水合物分别配制发酵培养基,进行发酵罐发酵并绘制生长曲线(图 3A、3B)。为测试不同厂家的三氯化铁六水合物对重组大肠杆菌发酵生物量的产出是否有影响,另选择南京 B 公司的
14、三氯化铁六水合物配制发酵培养基,进行发酵罐发酵并绘制生长曲线(图 3C)。三组氯化铁六水合物配制时,溶解后从颜色外观上观测,无明显差异。进行 0.22 m 滤膜过滤时,用吸潮的三氯化铁六水合物所配制的溶液,滤膜上过滤出更多的红褐色杂质。过滤后的颜色外观不存在明显差异。OD600 值 8765432101 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 时间(h)图 1 摇瓶培养重组大肠杆菌生长曲线 464 中国医药生物技术 2023 年 10 月第 18 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol,October 2023,Vol.18,No.5 OD600 值/
15、温度()140120100806040200补料速度(g/h)200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 发酵时间(h)A OD600 值/温度()140120100806040200补料速度(g/h)2001801601401201008060402002 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 发酵时间(h)B 图 2 接种种龄分别为 12 h(A)和 6 h(B)的重组大肠杆菌发酵的生长曲线 三组发酵的生长曲线对比,每小时的生物量产出差距
16、不大。培养 9 h,用吸潮批次发酵的 OD600 值达到 67,用干燥批次发酵的 OD600 值产出达到 64.4,用南京 B 公司批次发酵的 OD600 值达到 65,差距不大。IPTG 诱导后,吸潮批次的发酵收菌 OD600 值为 162.8,干燥批次的发酵收菌 OD600 值为 161.8。南京 B 公司批次的发酵收菌 OD600 值达到 184.8,高于安徽 A 公司的吸潮和干燥批次发酵 OD600 值。2.3 发酵液残糖含量的影响 调节控制一组发酵罐发酵液的残糖含量处于低水平,另一组发酵罐发酵液的残糖含量处于高水平。发酵结束,进行数据收集并绘制生长曲线(图 4)。低水平和高水平残糖含
17、量的发酵生长曲线比对,两者培养到 9 h 阶段的生物量产出相近。第 9 小时,低水平组的发酵液 OD600 值为 59.8,高水平组的发酵液 OD600 值达到 59.9。IPTG 诱导后根据残糖的含量和菌体量,控制补料的流加速度。调节控制一组发酵液的残糖含量处于较低的水平,另一组发酵液的残糖含量处于较高的水平。发酵结束时,低水平组(11.2 mmol/L)收菌 OD600 值达到 141.4,高水平组(11.2 mmol/L)收菌 OD600 值为 84,差异较大。3 讨论 冀成法等3优化发酵工艺后发酵结果的稳定性和重复性较好,最终菌体密度 OD600 值均能达 79 以上。晏星辰等5采用变
18、指数-恒 pH 法的策略发酵重组大肠杆菌,OD600 值达到 97。迟雷等6基于人工神经网络和遗传算法,对重组大肠杆菌高密度发酵工艺进行优化,OD600 值达到 125。本研究探究种龄、微量元素、残糖含量 3 种因素对重组大肠杆菌发酵生物量产出的影响。发酵前对种子预培养是为了获得大量活力旺盛的对数生长期重组菌以缩短发酵延滞期,增加生产强度,并且可确立重组菌的生长优势以减少染菌的可能性14。适宜的种龄应是菌体处于对数生长期的中后期15。将对数生长中后期的种子培养液接入发酵培养基可以保持很高的细胞活力,缩短发酵时间,并减少染菌的可能性。分析菌体摇瓶活化培养 15 h 绘制的生长曲线,第 6 小时是
19、菌体生长的对数中后期,是所测菌体适宜的种龄。在发酵罐培养中,种龄为 12 h 和种龄为 6 h 的重组大肠杆菌生长速度差异明显。在发酵周期为 29 h,收菌时菌体生物量 OD600 值差距 20 左右。在不存在发酵中其他未知影响因素干扰,通过实验发酵对比,种龄对于发酵生物量产出存在影响,选择合适的菌体活化时间有利于发酵生物量的提高。中国医药生物技术 2023 年 10 月第 18 卷第 5 期 Chin Med Biotechnol,October 2023,Vol.18,No.5 465 OD600 值/温度()140120100806040200补料速度(g/h)2001801601401
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基因工程 重组 大肠杆菌 发酵 生物量 产出 影响 因素 评估
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。