基于Illumina MiSeq测序技术探究冷藏菊黄东方鲀菌群演替规律.pdf
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1、生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 149基于Illumina MiSeq测序技术探究冷藏 菊黄东方鲀菌群演替规律曾 鹭1,刘淑集2,陈晓婷2,林河通1,*,刘智禹2,*(1.福建农林大学食品科学学院,福建 福州 350002;2.福建水产研究所 国家海水鱼类加工技术研发中心,福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室,福建 厦门 361013)摘要:为探究菊黄东方鲀0 冷藏期间菌群演替变化情况,通过16S rDNA测序技术检测冷藏过程中腐败菌属,鉴定冷藏后期的优势腐败菌,分析微生物菌群变化规律及优势腐败菌的致腐能力。结果显示,菊黄东方鲀冷藏货架期约为5 d。在冷藏初期(0
2、3 d),产生的菌属种类最为丰富,包括假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptophyta)、希瓦氏菌属(Shewanella)等,而冷藏后期(615 d)菌属种类较为集中,主要为假单胞菌属和希瓦氏菌属。分离鉴定10 株冷藏后期的优势腐败菌,证实希瓦氏菌属和假单胞菌属比例较高,符合菌群分布规律。同时,对几种常见优势腐败菌的致腐能力进行分析,其致腐能力由大到小依次为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescent)、产氮假单胞菌(P.azotoformans)、哈夫尼希瓦氏菌(Shewanella hafniensis)、波罗的海希瓦氏菌(S.baltica)。本
3、研究旨在为深入研究菊黄东方鲀冷藏期腐败机制和延长其货架期提供参考。关键词:菊黄东方鲀;高通量测序;菌群演替规律;优势腐败菌;致腐能力Using Illumina MiSeq High-throughput Sequencing to Explore the Succession of Microbial Community in Takifugu flavidus during Cold StorageZENG Lu1,LIU Shuji2,CHEN Xiaoting2,LIN Hetong1,*,LIU Zhiyu2,*(1.College of Food Science,Fujian Ag
4、riculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;2.National Research and Development Center for Marine Fish Processing,Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province,Fisheries Reasearch Instiute of Fujian,Xiamen 361013,China)Abstract:In order to
5、explore the microfloral succession in Takifugu flavidus during storage at 0,the spoilage bacteria were detected by 16S rDNA sequencing,the dominant spoilage bacteria in the late stage of storage were identified,and the changes in the microbial flora and the spoilage capacity of the dominant spoilage
6、 bacteria were analyzed.The results showed that the refrigerated shelf life of T.flavidus was about 5 days.In the early stage of storage(03 days),T.flavidus had the highest number of species of bacteria,including Pseudomonas,Streptophyta,and Shewanella,while in the late stage(615 days),the bacterial
7、 species were concentrated mainly in Pseudomonas and Shewanella.Ten dominant spoilage bacteria were isolated and identified,Shewanella and Pseudomonas accounting for a high proportion.Moreover,the spoilage capacity of several common dominant spoilage bacteria was analyzed,revealing that the decreasi
8、ng order of the spoilage capacity was Pseudomonas fluorescent P.azotoformans Shewanella hafniensis S.baltica.The results of this study provide a reference for understanding the spoilage mechanism of T.flavidus during cold storage and extending its shelf life.Keywords:Takifugu flavidus;high-throughpu
9、t sequencing;bacterial community succession;dominant spoilage bacteria;spoilage capacityDOI:10.7506/spkx1002-6630-20221108-082中图分类号:Q93 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)18-0149-08收稿日期:2022-11-08基金项目:福建省省属公益类科研院所基本科研专项(2022R1013008);福建省海洋服务与渔业高质量发展专项(FJHY-YYKJ-2022-1-9);福建省海洋保护与发展专项(2020)第一作者简介:曾鹭(1997)(O
10、RCID:0000-0002-9860-9433),女,硕士研究生,研究方向为生物与医药(食品领域)。E-mail:*通信作者简介:林河通(1967)(ORCID:0000-0002-8876-0199),男,教授,博士,研究方向为农产品加工及贮藏工程。E-mail:刘智禹(1972)(ORCID:0000-0003-2681-6967),男,教授级高级工程师,博士,研究方向为水产品加工与综合利用。E-mail:150 2023,Vol.44,No.18 食品科学 生物工程引文格式:曾鹭,刘淑集,陈晓婷,等.基于Illumina MiSeq测序技术探究冷藏菊黄东方鲀菌群演替规律J.食品科学,2
11、023,44(18):149-156.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221108-082.http:/ZENG Lu,LIU Shuji,CHEN Xiaoting et al.Using Illumina MiSeq high-throughput sequencing to explore the succession of microbial community in Takifugu flavidus during cold storageJ.Food Science,2023,44(18):149-156.(in Chinese with English a
12、bstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221108-082.http:/菊黄东方鲀(Takifugu flavidus)属鲀形目、鲀科、东方鲀属。其肉质细嫩,味道鲜美,营养丰富,蛋白质含量高,同时富含多种必需氨基酸和钾、磷、钙等多种矿物质1-2。菊黄东方鲀养殖区域主要分布在福建、山东、江苏、广东等沿海地区,且养殖的菊黄东方鲀需在经备案的加工厂处理后,以鲜品(04 冷藏)或冻品(18 贮藏)的形式进入市场流通3。然而,由于菊黄东方鲀体内蛋白质和水分含量较高,容易受到外源微生物的侵染,少部分微生物在鱼体内不断繁殖,迅速生长成为鱼体的特定腐败菌4-5,这些腐败菌往往
13、具有很强的致腐性6,会导致鱼肉组织结构分解,氧化酸败的速度加快,进而产生硫化物、醛、胺、有机酸等有害物质,严重影响鱼肉的品质和贮藏期7-8。鉴定并抑制引起菊黄东方鲀冷藏期间腐败变质的微生物菌群,是保持鱼肉品质和延长货架期的关键。传统分离培养技术鉴定菌种,需要多次纯化培养,分离得到单菌株后,再由进一步的生理生化实验鉴定得出结果。但是在培养过程中,只采用一种培养基进行培养时,不能或很难同时培养出所有的微生物,有些微生物需要在选择性培养基才能培养,所以如果想要较准确地培育出大部分微生物,需要采用多种不同的培养基同时进行培养,增加了许多工作量。高通量测序技术作为一种免培养的分子生物学技术,通过提取样品
14、中微生物的DNA或RNA进行生物信息学分析,从而得到具体的群落多样性信息9-10。它具有数据产出快速、通量高且分析全面等特点,能详细反映样本中微生物的菌落情况11。其中16S rDNA扩增子测序是指通过对V4区或V3V4区序列进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增再测序的方法,常被应用于研究样品中微生物群落组成结构,目前已被广泛应用于土壤、根际、环境、动物肠道以及食品等领域的研究中12-15,极大改变了人们对微生物生态学的认识。高通量测序技术在河鲀中的应用主要在于探究河鲀肠道微生物的菌群结构分布16-19,而针对冷藏过程中河鲀微生物菌群组成和特定腐
15、败菌的研究,仅李萌等20研究表明了导致冷藏红鳍东方鲀腐败变质的关键菌主要是荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescent)、莓实假单胞菌(P.fragi)、热杀索丝菌(Brochothrix thermosphacta)和乡间布丘氏菌(Buttiauxella gaviniae)。然而,不同品种、不同贮藏环境都会使腐败菌的种类发生改变21-24,有关菊黄东方鲀在冷藏条件下表面微生物变化的研究还鲜见相关报道。因此,本研究以菊黄东方鲀冷藏过程的菌落总数(total viable count,TVC)和挥发性盐基氮(total volatile basic nitrogen,TVB-N
16、)值测定结果为依据,确定贮藏终点,通过高通量测序技术分析养殖菊花东方鲀鱼肉在冷藏前期(03 d)、中期(36 d)、后期(615 d)的菌相演替变化规律,最终确定菊黄东方鲀冷藏期间的优势腐败菌及其致腐能力,以期为后期靶向抑制及品质控制提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂养殖菊黄东方鲀购于福建省漳州市漳浦县,养殖周期为2 a,体质量约(309.4172.72)g,体长约(22.521.14)cm。参照DB/T 20422021养殖菊黄东方鲀加工技术规范进行宰杀,去内脏、鱼皮、鱼头和鱼鳍,随后用冰水冲洗直至无污物无血水,沥干,于(02)冰箱保藏。甘油、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠
17、、无水碳酸钾、硼酸、水溶性胶、0.01 mol/L盐酸标准滴定溶液、甲基红、溴甲酚绿 国药集团化学试剂有限公司;LB营养琼脂、0.85%无菌生理盐水管 青岛海博生物技术有限公司;生理盐水 广东环凯微生物科技有限公司;TVC测试片 广东达元绿洲食品安全科技股份有限公司;Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒 生工生物工程(上海)股份有限公司;2Hieff Robust PCR Master Mix、Hieff NGSTMDNA Selection Beads 上海Yeasen 公司;pMD18-T Vector连接试剂盒 日本TaKaRa公司;Qubi
18、t3.0 DNA检测试剂盒 美国Life公司;E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 美国Omega公司。1.2 仪器与设备Pico-21台式离心机 德国Thermo Fisher公司;GL-88B旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司;TND03-H-H混匀型干式恒温器 深圳拓能达科技有限公司;DYY-6C电泳仪电源、DYCZ-21电泳槽 北京市生物工程 食品科学 2023,Vol.44,No.18 151六一仪器厂;FR-1000凝胶成像系统 上海复日科技有限公司;Q32866Qubit 3.0荧光计 美国Invitrogen公司;ETC 811 PCR仪 北京东
19、胜创新生物科技有限公司;3730XL测序仪 美国Applied Biosystems公司;DHP-9162恒温培养箱 太仓市科教器材厂;TH2-C恒温摇床 太仓市实验设备厂;HC-2518R冷冻高速离心机 英国BBI公司。1.3 方法1.3.1 TVC测定参考GB 4789.22016食品微生物学检验菌落总数测定。取1、3、5、7、9、11 d的鱼肉样品25 g,绞碎后加入225 g生理盐水,振荡混匀,静置3 min,取上清液,并进行梯度稀释,制成不同浓度的菌悬液。分别吸取1 mL菌悬液于TVC测试片中,30 培养48 h。1.3.2 TVB-N值的测定参考GB 5009.2282016食品中
20、挥发性盐基氮的测定中第三法微量扩散法进行测定。取1、3、5、7、9、11 d的鱼肉样品20 g,浸泡0.5 h后,取上清液进行测定。1.3.3 16S rDNA高通量测序1.3.3.1 实验材料及预处理取冷藏解冻后菊黄东方鲀的背部肌肉分别于0、3、6、9、12、15 d进行采样,并依次编号为R0、R3、R6、R9、R12、R15,后测序。1.3.3.2 细菌总DNA的提取参考李凯凯等25的方法,将绞碎后的样品加入适量钢珠和裂解液,放入2 mL离心管中,使用破碎仪破碎后用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit提取试剂盒进行提取。1.3.3.3 PCR扩增引物序列:341F
21、-CCTACGGGNGGCWGCAG;805R-GACTACHVGGGTATCTAATCC。第1轮扩增:反应体系(30 L)为2Hieff Robust PCR Master Mix 15 L、Bar-PCR Primer F 1 L、Primer R 1 L、PCR products 1020 ng、H2O 912 L;第2轮扩增:反应体系(30 L):2Hieff Robust PCR Master Mix 15 L、Primer F 1 L、Index-PCR Primer R 1 L、PCR products 2030 ng、H2O 912 L。1.3.4 优势腐败菌的分离鉴定参考孟凌
22、云等26的方法并稍作修改,将冷藏后期的样品搅碎,加入无菌水稀释到一定梯度,随后用接种环划线到固体培养基中,30 培养36 h,挑取不同形态的单菌落(共10 株)于LB液体培养基中扩大培养,划线纯化3 次后,菌液中加入20%的甘油进行保种,置于20 中保藏。菌种进行测序、鉴定。1.3.5 优势腐败菌致腐能力的比较参考赵宏强等27的方法对不同腐败菌致腐能力进行分析,并根据1.3.1、1.3.2节方法分别检测冷藏初期与末期时单位数量腐败菌产生的TVC和TVB-N值,以腐败代谢产物产量因子作为评估腐败能力的指标,按下式计算:TC1?TC0TN1?TN0?式中:TN1、TN0分别为末期和初期TVB-N值
23、/(mg/100 g);TC1、TC0分别为末期和初期TVC/(CFU/g)。1.4 数据处理利用mothur进行rarefaction分析,应用R软件制作曲线图。采用Excel 2007进行数据统计及处理,SPSS Statistics 21进行显著性分析,Origin 8.5绘制曲线。采用MEGA 11.0构建系统发育树。2 结果与分析2.1 菊黄东方鲀冷藏期间TVC和TVB-N值变化情况TVC和TVB-N与水产品鲜度密切相关,常用来反映水产品的腐败情况。有研究表明,可食用生鱼肉的TVC上限值为5.00(lg(CFU/g)28,Zhou Ran等29在4 冷藏条件下测得贮藏4 d的暗纹东方
24、鲀TVC为5.07(lg(CFU/g),而经过保鲜处理的河鲀鱼肉则是到6 d TVC才超过5.00(lg(CFU/g),河鲀的货架期延长了2 d。如图1所示,在贮藏过程中冷藏菊黄东方鲀的TVC逐渐增加,5 d达到了4.93(lg(CFU/g),接近生鱼肉可食用上限值,而在11 d TVC升至7.32(lg(CFU/g),超过食品中微生物的最高限值7.00(lg(CFU/g)30,因此可以说明菊黄东方鲀在冷藏情况下能贮藏5 d,冷藏到11 d已经腐败。3135791148765TVC?lg?CFU/g?/d图 1 菊黄东方鲀冷藏过程中TVC的变化Fig.1 Changes in total vi
25、able count of T.flavidus during cold storage根据GB/T 181082019鲜海水鱼通则规定,海水鱼TVB-N值一级鲜度界限值15.00 mg/100 g31,但是对于不同品种的鱼,其TVB-N值的可接受上限值不同,如鳕鱼鱼肉中TVB-N值的可接受上限为60 mg/100 g,银鲤和黑鲈则分别为35.00 mg/100 g和10.00 mg/100 g32-34,而根据马妍等35的研究结果,河鲀TVB-N值的上限为1213 mg/100 g。如图2所示,随着冷藏时间的延长,微生物数量不断增加,促进了蛋白质降解,使得菊黄东方152 2023,Vol.4
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