基于Caspase-1研究NLRP3_Caspase-1通路对成骨细胞焦亡作用机制.pdf
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1、外科研究与新技术 2023 年9 月第 12 卷 第 3 期 基于Caspase-1研究NLRP3/Caspase-1通路对成骨细胞焦亡作用机制于涛,王海牡丹江医学院附属第二医院骨外科,黑龙江 牡丹江 157000摘 要 目的通过调控半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)水平探讨核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/Caspase-1通路对成骨细胞焦亡的影响机制。方法培养小鼠胚胎MC3T3-E1成骨细胞,分为A组(高糖处理)、B组(高糖Caspase-1抑制剂处理)、C组(高糖Caspase-1 siRNA处理)和对照组。采用吸光法检测成骨细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放量,采用 H
2、oechst33342/PI 染色法检测成骨细胞焦亡情况,分别采用 RT-PCR 技术和Western blot技术检测成骨细胞中NLRP3、Caspase-1、白细胞介素-1(IL-1)和IL-18相对表达水平。结果A组、B组和C组MC3T3-E1成骨细胞焦亡比例和LDH活性均显著高于对照组,B组、C组焦亡比例和LDH活性显著低于A组(P0.05)。A组、B组和C组NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 mRNA和蛋白相对表达水平均显著高于对照组,B组、C 组 Caspase-1、IL-1、IL-18 mRNA 和蛋白相对表达水平显著低于 A 组(P0.05)。结论通过抑制Ca
3、spase-1能够抑制高糖引起的成骨细胞NLRP3升高导致的IL-1、IL-18升高,进而抑制成骨细胞焦亡作用。关键词 成骨细胞;细胞焦亡;Caspase-1;NLRP3/Caspase-1通路;Caspase-1抑制剂;NLRP3炎性小体中图分类号 R329.25 文献标志码 A 文章编号 2095-378X(2023)03-0163-05 doi:10.3969/j.issn.2095-378X.2023.03.002Study on the mechanism of NLRP3/Caspase-1 pathway on osteoblast pyroptosis based on Cas
4、pase-1YU Tao,WANG HaiDepartment of Orthopedic Surgery,The Second Hospital of Mudanjiang Medical College,Mudanjiang 157000,Heilongjiang,ChinaAbstract ObjectiveTo explore the mechanism of nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3(NLRP3)/cysteine aspartate specific proteinase-1(
5、Caspase-1)pathway on osteoblast pyroptosis by regulating the level of Caspase-1.MethodsMouse embryonic MC3T3-E1 osteoblasts were cultured and divided into group A with high sugar treatment,group B with high sugar+Caspase-1 inhibitor treatment,group C with high sugar+Caspase-1 siRNA treatment,and con
6、trol group.The level of lactate dehydrogenase(LDH)released from osteoblasts was detected by light absorption method,the osteoblast pyroptosis was detected by Hoechst33342/PI staining,and the NLRP3,Caspase-1,interleukin-1(IL-1),and IL-18 of osteoblasts were detected by RT-PCR and Western blot respect
7、ively.ResultsThe pyroptosis ratio and LDH activity of MC3T3-E1 osteoblasts in group A,B,and C were significantly higher than those in the control group,while those in group B and C were significantly lower than those in group A(P0.05).The relative expression levels of NLRP3,Caspase-1,IL-1,and IL-18
8、mRNA and protein in group A,B,and C were higher than those in the control group,while the relative expression levels of Caspase-1,IL-1,and 论著 基金项目 黑龙江省卫生健康委科研课题(2020-397)作者简介 于涛(1984),男,硕士研究生,主治医师,从事临床骨外科工作通信作者 王海,电子信箱:163Surg Res N Tech Vol.12,No.3,September 2023IL-18 mRNA and protein in group B an
9、d C were significantly lower than those in group A(P0.05).ConclusionInhibition of Caspase-1 inhibits the elevation of IL-1 and IL-18 caused by the elevation of NLRP3 in osteoblasts due to high glucose,thus inhibiting osteoblast pyroptosis.Key words Osteoblast;Pyroptosis;Caspase-1;NLRP3/Caspase-1 pat
10、hway;Caspase-1 inhibitor;NLRP3 inflammasome骨质疏松症是临床常见的一种骨代谢性疾病,其基本特征是骨密度降低、骨结构改变、骨脆性增加1。骨质疏松症发生的根本原因在于成骨细胞和破骨细胞之间的平衡被破坏,越来越多的研究发现多种因素能够造成成骨细胞死亡,破骨细胞过度活化,进而引起骨吸收过度和骨质疏松症,因此骨质疏松症也被认为是一种自身免疫性和炎性疾病,患者往往伴随体内炎性因子水平改变2。细胞焦亡是一种新发现的程序性细胞死亡途径,焦亡细胞的细胞膜上会形成许多 12 nm 孔洞,细胞膜失去完整性,通透性增加,最终细胞膜溶解,细胞内容物释放3。焦亡过程主要依赖于半胱
11、氨酸蛋白酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1),并伴有IL-1、IL-18等多种促炎因子表达上调,细胞膜破裂后促炎因子释放并募集炎症细胞,扩大炎症反应4。骨质疏松症成骨细胞焦亡目前仍较少有研究报道,本研究以小鼠胚胎MC3T3-E1成骨细胞作为研究材料,通过高糖法诱导细胞焦亡,分析核苷酸 结 合 寡 聚 化 结 构 域 样 受 体 蛋 白 3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)/Caspase-1 信号通路相关蛋白
12、和促炎因子表达情况,并探讨了通过抑制 Caspase-1表达调节该信号通路的可行性,旨在为骨质疏松发病机制和防治提供新思路,现报道如下。1 材料与方法 1.1细胞、主要试剂和仪器小鼠胚胎MC3T3-E1成骨细胞(中国科学院细胞库);-MEM 培养基、特级胎牛血清(美国 Gibco公司);二甲亚砜、胰蛋白酶、青链霉素双抗溶液(北京索莱宝科技有限公司);Caspase-1 抑制剂:AC-YVAD-CMK(Alexis 公 司);LDH 检 测 试 剂 盒、Hoechst33342/PI双染试剂盒(翌圣生物科技上海股份有限公司);总 RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒(德 国 QIAGEN 公 司);
13、SYRB Premix ExTaqTM(TAKARA 公司);RIPA 裂解液、BCA 试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术有限公司);蛋白质Marker(New England Biolabs公司);兔抗小鼠NLRP3、Caspase-1、白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、IL-18 和-actin单克隆抗体(美国 Abcam 公司);PVDF 膜(德国Millipore公司);NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18和-actin引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。CO2细胞培养箱(山东博科生物产业有限公司)
14、;MK3全自动酶标分析仪(ThermoFisher公司);垂直电泳仪、Trans Blot SD半干转膜仪、Chemi DOC XRS凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司);7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。1.2细胞培养和分组干预小鼠胚胎MC3T3-E1成骨细胞于-MEM培养基,37、5%CO2培养箱中培养,每2 d更换一次培养基,细胞铺满80%以上培养皿时采用胰蛋白酶消化后进行传代培养。至对数生长期时按照2106个/孔接种至6孔板或者按照2104个/孔接种至96孔板中,培养至细胞铺满6孔板75%80%时进行分组干预。A 组用含终浓度为 45 mmol/L 葡萄糖的-MEM 培养基
15、培养 24 h5;B 组用含终浓度为45 mmol/L 葡 萄 糖 和 终 浓 度 为 40 mol/L AC-YVAD-CMK 的-MEM 培养基培养 24 h;C 组用含终浓度为45 mmol/L葡萄糖的-MEM培养基培养,并转染siRNA;对照组采用正常-MEM培养基培养24 h。1.3Hoechst33342/PI染色法检测成骨细胞焦亡按照 Hoechst33342 溶液:PI 溶液:细胞染色缓冲液=1 1 200配制染色工作液。PBS缓冲液洗涤6孔板细胞3次后向每孔加入1 mL染色工作液,4 避光30 min后再次使用PBS缓冲液冲洗3次,荧光显微镜下观察成骨细胞焦亡情况。1.4吸光
16、度法检测成骨细胞LDH活性向96孔板细胞加入60 L LDH检测液,混匀后避光孵育30 min,2 000 r/min,离心5 min,取上清液150 L加入新96孔板中,使用酶标分析仪检测各孔490 nm波长吸光度,以LDH检测液调零,计算LDH活性。164外科研究与新技术 2023 年9 月第 12 卷 第 3 期 1.5RT-PCR 检 测 成 骨 细 胞 NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 mRNA表达采用总 RNA 提取试剂盒提取 6孔板成骨细胞总 RNA,逆 转 录 成 cDNA,以 cDNA 为 模 板 使 用SYRB Premix ExTaqTM RT-PCR
17、试剂盒检测NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 mRNA,以-actin 作为参照计算各基因相对表达水平。1.6Western blot检测成骨细胞NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 蛋白表达收集6孔板中全部细胞,加入预冷RIPA裂解液,充分破碎后,4 下12 000 g离心10 min,留取上清液备用。采用BCA蛋白试剂盒检测上清液总蛋白浓度。根据总蛋白浓度取适量上清液进行SDS-PAGE电泳,90 V 电泳 35 min 后转为 120 V 继续电泳60 min,电泳结束后转移至PVDF膜上,按照目标蛋白分子量大小切取条带,分别加入NLRP3、Caspas
18、e-1、IL-1、IL-18、-actin 蛋白一抗,4 过夜孵育。5%脱脂奶粉封闭1 h后加入二抗室温孵育2 h,ECL显色并曝光。采用Image J图像分析系统,以管家基因蛋白-actin作为参比计算相对吸光度值。1.7统计学方法采用SPSS 25.0统计学软件进行数据处理和分析。计量资料表示为x s,多组间比较采用单因素方差分析,两两组间比较采用LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果 2.1成骨细胞焦亡比较四组MC3T3-E1成骨细胞焦亡比例比较,差异有统计学意义(P0.05)。A组、B组和C组细胞焦亡比例均显著高于对照组,B组、C组焦亡比例显著低于A组(P0.05)。见
19、表1。2.2LDH活性比较四组MC3T3-E1成骨细胞LDH活性比较,差异有统计学意义(P0.05)。A组、B组和C组细胞LDH活性均显著高于对照组,B组、C组LDH活性显著低于A组(P0.05)。见表2。2.3NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 mRNA相对表达水平比较四组 MC3T3-E1 成骨细胞 NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 mRNA相对表达水平比较差异有统计学 意 义(P0.05)。A 组、B 组 和 C 组 NLRP3、Caspase-1、IL-1、IL-18 mRNA相对表达水平均显著高于对照组,B 组、C 组 Caspase-1、IL-
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