红色邻米草菌S2-4-1H%5E%28T%29摇瓶发酵产六氢环庚基灵菌红素的培养基配方优化.pdf
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1、第 卷第期 年 月泉州师范学院学报J o u r n a l o fQ u a n z h o uN o r m a lU n i v e r s i t yV o l N o O c t 红色邻米草菌S HT摇瓶发酵产六氢环庚基灵菌红素的培养基配方优化董乐,傅俊杰,李世琪,王芳,林晓思,黄兆斌,(福建省海洋藻类活性物质制备与功能开发重点实验室,福建 泉州 ;泉州师范学院 海洋与食品学院,福建 泉州 )摘要:产自红色邻米草菌株S HT的六氢环庚基灵菌红素(s i xh y d r o g e nc y c l o h e p t a n ep r o d i g i o s i n,S h c
2、 P G)具有极高抗肿瘤新药开发潜力为提高摇瓶发酵产S h c P G的产量,试验的菌株为红色邻米草菌S HT,基础培养基为MB,以庚基灵菌红素(h e p t y l p r o d i g i o s i n,h P G)和S h c P G质量浓度为响应值,在单因素试验基础上采用B o x B e h n k e n中心组合试验设计进行响应面实验,优化S HT菌株发酵的培养基组分,并构建二次回归方程结果表明,发酵培养基优化配方为:花生油、蛋白胨、无水氯化钙、六水合氯化镁和柠檬酸铁的质量浓度分别为、和 m g/m L在最佳发酵培养基配方工艺下发酵 h,h P G和S h c P G的总产量
3、为()m g/L、是用MB培养基培养产量的 倍,且预测值和测定值的绝对差值,表明回归模型可靠该结果对红色邻米草菌S HT发酵开发生产S h c P G具有实际应用价值关键词:红色邻米草菌;六氢环庚基灵菌红素;发酵培养基;B o x B e h n k e n中心组合设计;响应面实验收稿日期:作者简介:董乐(),男,河北丰南人,教授,硕士,主要从事生物活性物质的筛选及其开发利用研究基金项目:泉州市高层次人才创新创业项目(C R);福建省自然科学基金项目(J )中图分类号:T S 文献标识码:A文章编号:()灵红素(p r o d i g i n i n e s,P G s)家族是一类由三吡咯结构
4、组成的微生物生物碱类天然红色色素P G s家族中的灵菌红素(p r o d i g i o s i n,P G)于粘质沙雷氏菌(S e r r a t i am a r c e s c e n s)中首次被发现,并从该菌中分离出P G纯品,确定P G分子式为C H NO目前,P G s已被发现存在于沙雷氏菌属(S e r r a t i a)、假单胞菌属(P s e u d o m o n a s)、弧菌属(V i b r i o)、霍氏菌属(H a h e l l a)、假交替单胞菌属(P s e u d o a l t e r o m o n a s)、紫色杆菌属(J a n t h i
5、n o b a c t e r i u m)、链霉菌属(S t r e p t o m y c e s)、邻米草菌属(S p a r t i n i v i c i n u s)、无色杆菌属(A c h r o m o b a c t e r)和李氏红色菌属(Z o o s h i k e l l a)等多种微生物中据报道,已鉴定结构的P G s包括P G、十一烷基灵菌红素、环庚基灵菌红素(h e p t y l p r o d i g i o s i n,h P G)、间环灵菌红素、链玉红菌素B、灵菌红素R、壬基灵菌红素、甲基环庚基灵菌红素、类灵菌红素以及盐酸环状灵菌红素等 本实验室从红色邻
6、米草菌(S p a r t i n i v i c i n u s r u b e r)菌株S HT中分离鉴定获得六氢环庚基灵菌红素(s i xh y d r o g e nc y c l o h e p t a n ep r o d i g i o s i n,S h c P G),分子式为C H NO P G、十一烷基灵菌红素和类灵菌红素属于线性三吡咯结构,其他灵红素属于环状三吡咯结构 P G s被证明具有抗痢疾内变形虫、抗肿瘤、抗炎症细胞因子、神经调节、抗氧化 、抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗疟疾、抗克氏锥虫、抗寄生虫、免疫抑制、杀藻 和降解塑化剂 等作用值得关注的是,P G s对正常细胞系
7、具有低毒性或无毒性 在P G s的研究与开发上,P G相对较为深入P G不仅被用于各种癌症的实验药物,且被用作先导物合成了一种灵菌红素衍生物(G X 或简称o b a t o c l a x)O b a t o c l a x被用于治疗晚期慢性淋巴细胞白血病的I期临床试验,并被证明具有良好的安全性 因此,P G s在临床药物开发、环境处理、食品添加剂制备等方面具有巨大的潜在应用价值,在全球市场上占有越来越重要的地位 P G s可以通过化学合成和微生物生产进行制备P G s化学合成的步骤多、反应成本高、合成速率低,而其微生物生产具有环境友好、条件温和、低成本、易于工业化的优点,因此,P G s的
8、微生物生产被认为是其制备的发展方向 然而,在P G s的微生物生产中目前仍存在着产量低的问题 高水平的微生物发酵色素产品依赖于优良的微生物菌株和有效的发酵方法P G s作为微生物的次生代谢产物,其生产取决于培养基组成、生产条件、发酵方法和微生物菌株等许多因素 优化发酵工艺参数的一个经典方法是一次改变一个因素(如氮源、碳源、矿物质、p H值、温度等)而保持其他参数不变,但这一方法不仅耗时、费力,而且不能确定各种参数的同时交互作用 响应面法(r e s p o n s e s u r f a c em e t h o d o l o g y,R S M)是同时考虑几个因素变化时优化工艺参数的最常用
9、的统计工具,它不仅提供了关于直接效应、成对组合交互效应和变量参数的曲线变量效应的全面知识,而且省时省力本实验室从红色邻米草菌菌株S HT中分离鉴定了h P G和S h c P G(以下称h P GS h c P G),其中S h c P G为首次发现,S h c P G的含量占h P GS h c P G总含量的 以上,并且S h c P G对肿瘤细胞A 的半抑制浓度(h a l f i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n,I C)值为()m o l/L,其抑制效果为P G的 倍、顺铂的 倍 因此,S h c P G具有极高的研究价值和抗肿瘤新
10、药开发潜力目前,国内P G的价格高昂,m g 纯度P G的价格约 元,限制了其进一步的开发和应用,如何优化微生物发酵条件提高P G产率依然是国内外学者的研究重点 S h c P G的研究重点在于:如何优化Sr u b e r菌株S HT通过摇瓶发酵产S h c P G的工艺,以提高S h c P G的产率本研究通过单因素试验对菌株S HT发酵工艺的培养基配方进行考察,在此基础上通过R S M实验对菌株S HT的h P GS h c P G摇瓶发酵培养基配方进行优化,以期得到稳定可靠的菌株S HT摇瓶发酵产h P GS h c P G的发酵工艺参数数据,旨在为S h c P G的工业化生产提供科
11、学依据材料与方法材料与试剂红色邻米草菌(Sr u b e r)菌株S HT,由本实验室分离鉴定并保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心(保藏编号:MC C C K TK C T C T),已完成对该菌株的形态学观察、生理生化鉴定、Sr D NA鉴定P G(相对分子质量为 )、S h c P G(相对分子质量为 ),纯度均达 以上,由本实验室纯化制备,华侨大学分析测试中心核磁鉴定;金龙鱼纯正花生油,嘉里粮油(青岛)有限公司生产;海生菌肉汤 (M a r i n eB r o t h ,MB)和琼脂粉,生物级,美国B e c t o n,D i c k i n s o na n dC o m p a
12、 n y公司生产;酵母粉胰蛋白胨,生物级,美国O X O I D公司生产;其他试剂均为国药集团化学试剂有限公司生产,分析纯实验方法菌种活化将本实验室保存的菌株解冻后划线接种于MB的固体培养基上,于 C恒温条件下培养 h挑取生长状态好的红色单菌落于MB的液体培养基中,于 C、r/m i n振荡培养 h,待培养液呈红色后于 C冷藏,备用其中,配制每升MB液体培养基,应在(多少)m L去离子水中加入 gMB粉;配制每升MB固体培养基,应在每升MB液体培养基中加入 g琼脂粉发酵培养基的优化()发酵基础培养基中碳源氮源的确定按照MB培养基成分配方,在其他成分不变的情况下,将碳源分别替换为葡萄糖和花生油,
13、氮源分别替换为酵母粉、蛋白胨,并将碳源氮源进行两两组合配制成种发酵基础培养基,其中碳源和氮源的浓度均为m g/m L种发酵基础培养基经高压灭菌温度降至室温后,按 的比例分别接入中活化备用的菌液,于 C、r/m i n振荡培养 h后,提取发酵液中h P GS h c P G产物并进行含量的测定比较不泉州师范学院学报 年 月同碳源氮源组合对h P GS h c P G产量的影响,选择最优的碳源氮源组合进行单因素试验()发酵培养基单因素试验按照MB培养基成分配方,其他成分不变,主要考察无水氯化钙(以下简称氯化钙)、六水合氯化镁(以下简称氯化镁)和柠檬酸铁的添加量等因素对发酵液中h P GS h c
14、P G产量的影响因素水平见表()发酵培养基的R S M实验设计根据B o x B e h n k e n中心组合试验设计原理,综合单因素试验结果,选取氯化钙、氯化镁、柠檬酸铁的添加量作为自变量,以Sr u b e r菌株S HT发酵液中h P GS h c P G的质量浓度为响应值,进行因素水平的R S M中心组合设计,优化摇瓶发酵h P GS h c P G的培养基配方试验因素和水平见表表发酵培养基单因素试验因素水平T a b L e v e l sa n df a c t o r so f s i n g l e f a c t o r t e s t f o r f e r m e n
15、t a t i o nm e d i u mm g/m L序号花生油蛋白胨氯化钙氯化镁柠檬酸铁 表发酵培养基优化试验的因素水平T a b T a b l eo f f a c t o r sa n d l e v e l s f o r f e r m e n t a t i o nm e d i u mo p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n t s m g/m L水平因素A(氯化钙)B(氯化镁)C(柠檬酸铁)发酵液中h P GS h c P G产量的测定标准曲线的绘制以h P GS h c P G纯品为标准样品,以其无水乙醇溶液的质量浓度为横坐标,于
16、 n m下的吸光度(A )值为纵坐标,绘 制 标 准 曲 线,得 到 回 归 方 程 为y x (R ),表明h P GS h c P G纯品质量浓度在 m g/L时,A 值和h P GS h c P G的质量浓度呈现良好的线性关系发酵液中h P GS h c P G产量的测定发酵完成后,将Sr u b e r菌株S HT发酵液和乙酸乙酯按照体积混合,充分超声破碎菌体细胞,静置后取mL上清液于 r/m i n离心m i n 将离心后上清液全部移至另一离心管中,待乙酸乙酯挥发完全即获得h P GS h c P G产物用无水乙醇溶解h P GS h c P G产物并全部转移到 mL比色管中,定容至
17、 mL定容后的溶液于 r/m i n离心m i n,移取上清液,采用比色法测定溶液中的h P GS h c P G产量数据处理所有实验的重复次数均为次,数据表示为平均值标准差采用D e s i g n E x p e r t分别对发酵培养基配方和发酵条件进行R S M试验设计、方差分析及二次方差分析、绘制等高线图和响应曲面图,采用M i c r o s o f tO f f i c e 进行基本的图表制作、绘制单因素试验相关曲线图实验结果与分析发酵基础培养基中碳源氮源的确定不同碳源氮源组合下h P GS h c P G的产量见表由表中可知,在相同碳源和氮源浓度下,花生油和蛋白胨组合培养时Sr
18、u b e r菌株S HT发酵液中h P GS h c P G浓度最大,且与其他组合相比差异有统计学意义表不同碳源氮源组合下h P GS h c P G的产量T a b h P GS h c P Gy i e l d so fd i f f e r e n t c o m b i n a t i o n so f c a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c e sm g/L碳源酵母粉蛋白胨碳源酵母粉蛋白胨葡萄糖 a A a A花生油 b B c C注:小写字母表示P,差异有统计学意义);大写字母表示P,差异有统计学意义第期董乐,等:红色邻米草菌S HT摇瓶
19、发酵产六氢环庚基灵菌红素的培养基配方优化发酵培养基单因素试验花生油添加量对h P GS h c P G产量的影响花生油添加量对Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G产量的影响见图由图可知,当发酵培养基中花生油添加量在()m g/m L时,h P GS h c P G产量呈上升趋势;当花生油浓度大于m g/m L时,h P GS h c P G产量开始降低;并且当花生油添加量为m g/m L时,Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G的产量达最大值因此,发酵培养基中的花生油添加量在()m g/m L时适合Sr u b e r菌株S HT发酵产
20、h P GS h c P G蛋白胨添加量对h P GS h c P G产量的影响蛋白胨添加量对Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G产量的影响见图由图可知,当发酵培养基中的蛋白胨添加量为m g/m L时,Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G产量呈上升趋势;当蛋白胨添加量为m g/m L时,h P GS h c P G的产量呈下降趋势;当蛋白胨添加量为m g/m L时,Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G产量达最大值因此,发酵培养基中的蛋白胨添加量为m g/m L时适合Sr u b e r菌株S HT发酵产h
21、 P GS h c P G图不同花生油添加水平下h P GS h c P G产量图不同蛋白胨添加水平下h P GS h c P G产量F i g h P GS h c P Gp r o d u c t i o na td i f f e r e n th P GS h c P Gy i e l dw i t hd i f f e r e n tp e p t o n ep e a n u to i l s u p p l e m e n t a l l e v e l ss u p p l e m e n t a l l e v e l s氯化钙添加量对h P GS h c P G产量的影响氯
22、化钙添加量对Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G产量的影响见图由图可知,当发酵培养基中的氯化钙添加量为 m g/m L时,Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G产量呈上升趋势;当氯化钙添加量大于 m g/m L时,h P GS h c P G的产量急剧下降,并且当氯化钙添加量为 m g/m L时,Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G产量达最大值,因此在Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G发酵的R S M法优化分析确定最佳工艺参数水平时,培 养 基 中 的 氯 化 钙 添 加 量
23、 适 合 选 择 在 m g/m L氯化镁添加量对h P GS h c P G产量的影响氯化镁添加量对Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G产量的影响见图由图可知,当发酵培养基中的氯化镁添加量为m g/m L时,Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G产量呈上升趋势;当氯化镁添加量大于 m g/m L时,h P GS h c P G的产量开始下降;当氯化镁添加量为m g/m L时,Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G产量达最大值因此,在Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G发酵的R
24、S M法优化分析确定最佳工艺参数水平时,培养基中的氯化镁添加量适合选择在 m g/m L泉州师范学院学报 年 月图不同氯化钙添加水平下h P GS h c P G产量图不同氯化镁添加水平下h P GS h c P G产量F i g h P GS h c P Gy i e l da td i f f e r e n t F i g h P GS h c P Gy i e l da td i f f e r e n tm a g n e s i u mc a l c i u mc h l o r i d es u p p l e m e n t a l l e v e l sc h l o r i
25、 d es u p p l e m e n t a l l e v e l s图不同柠檬酸铁添加水平h P GS h c P G产量F i g h P GS h c P Gy i e l da td i f f e r e n t f e r r i cc i t r a t es u p p l e m e n t a l l e v e l s柠檬酸铁添加量对h P GS h c P G产量的影响柠檬酸铁添加量对Sr u b e r菌株S HT发酵产h P GS h c P G产量的影响见图由图可知,当发酵培养基中的柠檬酸铁添加量为 m g/m L时,Sr u b e r菌株S HT发酵产
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