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基于PCR-HRM的水稻氮高效基因NRT1.1B功能标记开发及应用.pdf
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1、 山 东 农 业 科 学():./.收稿日期:基金项目:国家水稻产业技术体系济宁试验站项目()济宁市重点研发计划项目()山东省农业科学院农业科技创新工程项目()山东省重点研发计划(乡村振兴科技创新提振行动计划)项目()山东省农业良种工程项目()作者简介:房文文()女山东肥城人博士助理研究员主要从事水稻抗病育种研究:.通信作者:张士永()男山东寿光人研究员主要从事水稻育种研究:.基于 的水稻氮高效基因.功能标记开发及应用房文文王海凤郭涛薛芳姜艳芳张焕霞张士永(山东省农业科学院湿地农业与生态研究所/山东省水稻工程技术研究中心山东 济南)摘要:水稻对氮肥的高效与合理利用是发展绿色农业的重要保障 培育
2、含有氮高效基因的水稻品种是提高氮肥利用率最经济有效的途径 本研究开发了一个用于(高分辨率熔解曲线)高通量检测硝酸盐转运蛋白基因.的分子功能标记 利用此标记对 份山东地方水稻品种进行.基因分型发现有 个水稻品种为含有.的高效单倍型表明.在山东省水稻品种中分布较少 利用测序分析验证测序结果与本标记分型结果一致 可见本研究开发的功能标记能够快速准确鉴定出.基因型可为筛选和培育氮高效水稻新品种提供有力的技术支撑关键词:水稻高分辨率熔解曲线()氮高效基因.分子功能标记中图分类号:文献标识号:文章编号:().(/).().().水稻作为重要的粮食作物稻谷的稳产与增产对粮食安全至关重要 氮素是水稻需求量最大
3、的营养元素也是制约水稻产量的关键因子 化肥尤其是氮肥的施用对水稻增产和改善稻米品质起了重要作用 但近年来氮肥施用过量已成为水稻生产中普遍存在的问题对生态环境造成了严重破坏 因此培育养分高效型水稻新品种是解决这一问题的关键研究表明籼稻的氮肥利用率显著高于粳稻 培育和选育氮肥利用率高的粳稻品种是困扰育种工作者的难题 等研究揭示了籼、粳稻亚群氮肥利用差异的遗传基础发现硝酸盐转运蛋白基因.单碱基变异是导致籼、粳稻间氮肥利用效率差异的主要原因将籼型.导入粳稻能大幅度提高其氮利用效率即在氮肥减半的条件下产量较对照增加 氮肥利用效率提高 在正常施肥条件下增产 氮肥利用效率提高约 基因序列比对发现籼稻中.基因
4、编码区第 位碱基为 而其在粳稻中等位基因碱基为 从而使编码蛋白的第 位氨基酸分别为蛋氨酸和苏氨酸 根据.基因变异位点方琳等开发了特异性功能标记牛付安等开发了 标记并开展了氮高效粳稻育种 本研究根据.基因的 位点开发了一个用于 检测方法的分子标记并经测序方法验证标记的正确性然后用其对 份山东省地方品种进行.基因分型鉴定为培育氮高效水稻新品种提供技术支持 材料与方法.试验材料水稻材料包括.材料、对照品种日本晴及 份山东省地方品种 由山东省农业科学院湿地农业与生态研究所李平波博士提供其他水稻材料均由山东省种质资源团队收集和保存以常规方法栽培试剂 及 仪 器:十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵()
5、购于生工生物工程(上海)股份有限公司 试剂北京全式金生物技术()有限公司 核酸染料美国 公司 智能型生化培养箱、人工气候培养箱宁波江南仪器厂 型立式冰箱青岛海尔股份有限公司罗氏 实时荧光定量 仪 公司.基因序列分析及标记开发对.基因序列进行分析利用.与其等位基因及对照品种日本晴中的序列差异应用 软件根据差异的 设计引物对 引物均由华大基因公司合成.提取、扩增及 检测采用 法提取水稻样品的基因组 反应体系:母液 模板 正反向引物各.(./).扩增程序:预变性 变性 退火 延伸 共 个循环最后 延伸 后 保存 扩增完成后熔解曲线分析的程序为:变性 退火 以./的速率升温 次/采集荧光信号至 保持
6、采用 软件进行熔解曲线分析 结果与分析.序列分析及功能标记的设计根据.基因编码区第 位的 变异位点设计分子标记根据位点上下游基因序列设计了 条引物见表 表.基因分子标记引物序列引物引物序列()退火温度/.测序.测序.功能标记的检测及方法分别利用引物组合.、.、.、.对日本晴和 进行扩增分型结果表明利用.引物组合得到的熔解曲线比较平滑能够对两种基 山 东 农 业 科 学 第 卷因型的样品进行多态性区分(图)最终选择.组合作为本研究后续试验采用的引物对 利用日本晴和 对筛选的引物对.的基因分型效果进行验证能够检测出 为含有.基因的高效单倍型而日本晴为不含.基因的野生型红色曲线为含有.基因的高效单倍
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