基于BSA-seq方法挖掘大豆再生相关候选基因.pdf
《基于BSA-seq方法挖掘大豆再生相关候选基因.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《基于BSA-seq方法挖掘大豆再生相关候选基因.pdf(14页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2023,49(11):29352948 http:/zwxb.chinacrops.org/ISSN 0496-3490;CN 11-1809/S;CODEN TSHPA9 E-mail: 本研究由国家自然科学基金项目(31971899,32272093),国家重点研发计划项目(2021YFD120160204,2021YFD12011040202)和黑龙江省自然科学基金项目(TD2022C003,JJ2022YX0475)资助。This study was supported by the National Natural Scien
2、ce Foundation of China(31971899,32272093),the National Key Research and De-velopment Program of China(2021YFD120160204,2021YFD12011040202),and the Heilongjiang Natural Science Foundation(TD2022C003,JJ2022YX0475).*通信作者(Corresponding authors):武小霞,E-mail:;赵莹,E-mail:*同等贡献(Contributed equally to this wor
3、k)第一作者联系方式:赵宇晶,E-mail: Received(收稿日期):2022-12-12;Accepted(接受日期):2023-04-17;Published online(网络出版日期):2023-05-12.URL:https:/ This is an open access article under the CC BY-NC-ND license(http:/creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).DOI:10.3724/SP.J.1006.2023.24276 基于 BSA-seq 方法挖掘大豆再生相关候选基因 赵宇晶1,*张
4、滨烁1,*苏安玉2 于振海1 李佳欢1 林 洋1 张艳婷1 武小霞1,*赵 莹1,*1东北农业大学农学院,黑龙江哈尔滨 150030;2东北农业大学资环学院,黑龙江哈尔滨 150030 摘 要:转基因生物育种技术可以定向改良大豆品种,为大豆定向育种提供一种新思路。为寻找与大豆再生相关的基因,探索大豆再生规律、提高遗传转化效率,本研究利用再生能力强材料东农 50、再生能力弱材料 Keburi 及其子代 RIL 群体的 200 份材料进行大豆器官发生试验,比较不同基因型之间再生能力的差异,筛选出极端材料各 20 份,后通过 BSA-seq(bulked segregant analysis seq
5、uencing)技术对大豆再生候选基因进行初步定位,共获得 88.04 G 的clean data,平均测序深度为 20.03,定位到 2 Mb 区间,利用 GO 等数据库对区间内基因进行富集分析,差异表达基因主要富集在纤维素微纤维组织、植物型细胞壁组织或生物发生等 20 个条目中,其中被显著富集的植物型细胞壁组织或生物发生条目中共有 6 个基因,对 6 个基因进行组织表达量分析,在丛生芽伸长期间表达水平较高,说明其在大豆再生过程中发挥作用,可能为影响大豆再生的关键基因。本研究为大豆再生机制研究提供了重要的候选基因信息与必要的材料基础。关键词:大豆;再生;器官发生;BSA-seq Mining
6、 candidate genes related to soybean regeneration based on BSA-seq method ZHAO Yu-Jing1,*,ZHANG Bin-Shuo1,*,SU An-Yu2,YU Zhen-Hai1,LI Jia-Huan1,LIN Yang1,ZHANG Yan-Ting1,WU Xiao-Xia1,*,and ZHAO Ying1,*1 College of Agronomy,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,Heilongjiang,China;2 College o
7、f Resources and Environment,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,Heilongjiang,China Abstract:Transgenic breeding technology can improve soybean directionally,and provide a new idea for improving soybean yield.In order to search for the genes related to soybean regeneration,explore the rul
8、es of soybean regeneration,and improve the efficiency of genetic transformation,we conducted soybean organogenesis experiment with 200 materials including DN50(a ma-terial with strong regeneration ability),Keburi(a material with weak regeneration ability),and RILs of its offspring with strong regene
9、ration ability.Compared the differences in regeneration ability between different genotypes,20 extreme materials each were screened.Preliminary localization of soybean regeneration candidate genes by BSA-seq(bulked segregant analysis se-quencing)technology,88.04 G clean data were obtained in the 2 M
10、b interval with an average sequencing depth of 20.03.The differentially expressed genes were mainly enriched in 20 items such as cellulose microfiber tissue,plant type cell wall tissue,or biogenesis,among which there were 6 genes in plant type cell wall tissue or biogenesis item significantly enrich
11、ed.The tissue expression analysis of 6 genes showed that the relative expression level was high during cluster bud elongation,which indicating 2936 作 物 学 报 第 49 卷 that it played a role in the process of soybean regeneration and might be the key gene affecting soybean regeneration.This study provides
12、 the basic materials for breeding new regenerated soybean varieties,and confirms the feasibility of BSA-seq technology in mining regenerated genes.Keywords:soybean;regeneration;organogenesis;BSA-seq 大豆(Glycine max(L.)Merr.)是世界最大的植物蛋白来源和重要的食用油脂来源。能够为人类提供优质的植物蛋白。大豆作为世界上种植面积最大的转基因作物,转基因大豆的种植面积逐年增加,占到全部
13、转基因作物的 50%以上1。但目前,大豆遗传转化效率较低,主要是由于大豆的再生系统不稳定,其中再生效率和频率受基因型影响明显2-4,这就限制了将遗传转化生物技术应用在大豆遗传改良上。因此,寻找和建立易操作、高效率、稳定性好的大豆再生体系是提高大豆遗传转化效率的重要前提和保障5。器官发生途径是指通过外植体诱导产生丛生芽后丛生芽伸长形成根,最终形成完整植株的过程。该途径具有诸多优点如外植体容易获得,不受季节限制等。Cheng 等1在高浓度 6-BA 的培养基中放置大豆子叶节后诱导出丛生芽,获得再生植株;Kartha6采用栽培大豆真叶通过器官发生来再生植株;Paz 等7使用大豆的半种子作为外植体,使
14、大豆子叶节技术进一步改进,简化了流程,提高了大豆的转化效率;王怡婷等8采用过氧化氢对种子进行消毒改进种子灭菌方法;Li 等9对农杆菌介导的大豆转化提供了改进的方案,优化了激素浓度组合。近年来,植物的再生机制研究受到人们的广泛关注,对再生基因的研究报道也越来越丰富,在此前的研究中已经发现并克隆了一些影响植物再生的基因,植物干细胞拥有自我更新的能力并不断分化,主要位于根尖分生组织(root apical meristem,RAM)和茎尖分生组织(shoot apical meristem,SAM),而植物在形态过程中的细胞都是来源于植物干细胞,干细胞对于调控植物的再生也就具有重要意义。植物再生离不
15、开干细胞对与 SIM 和 SEM 的调控,STM 基因、CLV3 和 WUS 基因作为植物干细胞的明星基因,也就被当作提高植物再生能力的关键。最早发现的CLV3 基因作为干细胞的最有明显功能的基因10,将 CLV3 基因作为标记后可以将植物内的细胞分为干细胞和非干细胞。1996 年首次报道的 STM 蛋白是分生组织内干细胞的激活和关键调控因子11-12。2002 年通过遗传学手段发现 WUS 基因在胚胎发育过程中起着关键作用13,发现在拟南芥上是干细胞调控的正调控的转录因子14。Mayer 等15在拟南芥中分离得到了 WUS 基因,发现了 WUS 参与植物分生组织的形成。而 3 个核心基因是如
16、何调控植物干细胞的也就成为了大家关注的核心,近几年来大家也陆续发现三者有着精密的互作模式,对于植物分生组织的干细胞调控有着重要意义。2020 年发现STM 可以调控和激活 CLV3 的转录,并与 WUS 相互作用,WUS 也可以激活 STM 的表达,CLV3 通过 WUS和STM的相互作用可以负调控WUS基因的转录,从而可以控制干细胞的大小16。评定一个植物再生能力的好坏不定芽的数目也是关键,在拟南芥中发现ESR1 作为 ERF 家族的转录因子,ESR1 可以与它的同源基因ER2可以促进芽的再生,证明了ESR1可以促进茎尖分生组织的形成17。Banno 等18研究表明过量表达 ESR1 基因可
17、以增加不定芽的数目。而植物的再生同样也离不开体细胞胚的发育,BBM 作为体细胞胚的关键调控的转录因子。蔡英卿19发现 BBM可以促进体细胞胚胎发育,将 BBM 进行拟南芥转化后发现 BBM 可以使拟南芥再生促进植物的恢复20,BBM可以促进细胞的全能性,有研究表明BBM可以调控2个细胞全能性的关键调节因子LEC1和LEC2,同样也发现 BBM 介导的体细胞胚需要 LAFL 基因的帮助21。并且,李思楠等22通过体细胞胚试验筛选到与再生相关的基因 BBM 并证实其促进再生。近几年来随着测序手段的提高与成本的下降,使得全基因组测序的 BSA(bulked segregant analysis)方法
18、可以用来进行挖掘候选基因,被广泛应用于大豆23-27、番茄28、水稻29-30、黄瓜31等作物基因定位与基因挖掘。然而,到目前为止 BSA-seq 技术应用于大豆再生相关基因的挖掘研究尚未见报道。本研究采用器官发生途径筛选 200 份群体材料,对父母本及后代 2 个极端混池共 4 份材料使用 BSA技术,通过全基因组测序,定位与再生性状相关联的区域,对区域内候选基因进行生物信息学分析、表达模式分析,旨在筛选再生能力强的基因型及与大豆再生相关的基因,提高大豆遗传转化效率。1 材料与方法 1.1 试验材料 本研究所使用的 RIL群体材料于2017年以东农第11期 赵宇晶等:基于 BSA-seq 方
19、法挖掘大豆再生相关候选基因 2937 50(东北农业大学,哈尔滨)为母本,日本品种 Keburi(日本)为父本杂交后进行自交,逐年筛选农艺性状稳定的材料进行种植,得到稳定 200 份的重组自交系(recombinant inbred lines,RILs)材料。本试验使用F5代自交种子材料进行器官发生试验。1.2 大豆器官发生试验 挑选表面光滑、无病斑、大小一致的大豆种子放入灭菌后的锥形瓶中,使用 75%的无水乙醇浸泡5 min对种子表面进行消毒,后倒入 15%过氧化氢放入 37摇床中 110 转 min1 15 min。用无菌水冲洗56 次至表面干净无浮沫。倒入约 200 mL 无菌水浸泡,
20、常温避光放置 24 h。将浸泡好的种子沿下胚轴切开,一分为二,下胚轴切至 23 mm,切除腋芽,将切好的外植体下胚轴朝下插入 SIM 丛生芽诱导培养基中培养 14 d,然后将长出丛生芽移至 SEM 丛生芽伸长培养基中,放置 14 d 后继代一次。将伸长的苗放置在 RM 生根培养基中等待生根,统计数据。大豆器官发生试验过程如图 1 所示。培养基配方如下。SIM 丛生芽诱导培养基:3.21 g mL1 B5+0.6 g mL1 MES+30 g mL1蔗糖,pH 5.75.8灭菌后加入 B5、6-BA;SEM 丛生芽伸长培养基:4.33 g mL1 MS+0.6 g mL1 MES+30 g mL
21、1蔗糖,pH 5.75.8 灭菌后加入 B5、IAA、GA3、Glu、Asp;RM生根培养基:1.605 g mL1 B5+0.6 g mL1 MES+20 g mL1蔗糖,pH 5.8 灭菌后加入 B5、Asp、Glu。图 1 器官发生试验流程图 Fig.1 Flow chart of organogenesis test A:萌发;B、C:诱导丛生芽;D:丛生芽伸长;E、F:生根培养。A:seed germination;B,C:clustered bud induction;D:clumps of buds elongated;E,F:rooting culture.1.3 表型分析 根
22、据材料的生长情况,统计各项数据,对再生情况进行鉴定,各试验材料每个处理 20 个外植体,2 次重复,以下为统计指标。再生潜力(regenerative potential,RP):丛 生芽数/外植 体数;再 生能力(regenerative ability,RA):伸长苗数/丛生芽数;再生效率(regenerative efficiency,RE):伸长苗数/外植体数;再生率(regenerative rate,RR):生根数/外植体数。采用 SPSS 21.0 将 4 个指标综合计算特征值、贡献率、主成分、隶属函数及 D 值。根据 D 值筛选强再生和弱再生的材料各 20 份。1.4 BSA
23、混池定位 选取双亲、20 份强再生材料和 20 份弱再生材料的幼嫩叶片,提取 DNA,样品基因组进行琼脂糖凝胶电泳检测,将检测合格后的 DNA 进行 11 的混合,利用超声波将亲本和混池 DNA 序列形成随机片段,对随机片段化的 DNA 依次进行末端修复、3端加 A、连接测序接头后,再利用磁珠吸附富集基因组长度 350 bp 左右的片段,经过 PCR 扩增形成测序文库。后根据欧式距离(Euclidean Distance,ED)算法评估与性状关联区域32。ED 值越高,代表该点关联效果越好。222mutwtmutwtmutwtmutwtED()2()()()AACCGGTT 式中,Amut为
24、A碱基在突变混池中的频率,Awt为 A碱基在野生型混池中的频率;Cmut为C碱基在突变混池中的频率,Cwt为 C碱基在野生型混池中的频率;Gmut为 G 碱基在突变混池中的频率,Gwt为 G 碱基在野生型混池中的频率;Tmut为 T 碱基在突变混池中的频率,Twt为 T 碱基在野生型混池中的频率。1.5 候选基因定位及分析 以 Glycine max Wm82.a2.v1(Phytozome info:G.max Wm82.a2.v1(doe.gov)为参考基因组,根据所得到的 QTL 区间,对候选区段内的基因进行鉴定。利用基因功能注释等对候选基因进行功能注释。1.6 候选基因实时荧光定量 P
25、CR 选取 SIM-0 d、SIM-14 d、SEM-3 d、SEM-5 d、SEM-7 d、SEM-14 d(丛生芽诱导 0 d、14 d;丛生芽 2938 作 物 学 报 第 49 卷 伸长 3、5、7、14 d)共 6 个时期的亲本材料 DN50、极端材料Z14及Z39,进行RNA的提取,提取步骤参照 RNA 提取试剂盒(OMEGA Plant RNA Kit(50),R6827-01)试剂盒)说明书进行。将提取的 RNA 反转录为单链 cDNA,试验步骤参照 RNA 反转录试剂盒(HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wipe
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 基于 BSA seq 方法 挖掘 大豆 再生 相关 候选 基因
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。