黄连素对高盐高糖诱发秀丽隐杆线虫形态及寿命改变的干预作用.pdf
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1、山东医药2023 年第 63 卷第 26 期黄连素对高盐高糖诱发秀丽隐杆线虫形态及寿命改变的干预作用徐婋,卢涛,李珂,徐佳宁,刘小愉,杜鹏云,张成岗北京中医药大学生命科学学院,北京102488摘要:目的探讨黄连素对高盐高糖诱发的秀丽隐杆线虫形态和寿命改变的干预作用。方法取秀丽线虫进行培养,随机分为正常对照组、高盐组、高糖组、高盐高糖组。正常对照组加入线虫NGM培养基;高盐组、高糖组、高盐高糖组下设模型对照组、10 mg/L黄连素干预组、20 mg/L黄连素干预组,先分别加入高盐培养基(含0.7%氯化钠的线虫NGM培养基)、高糖培养基(含1%葡萄糖的线虫NGM培养基)、高盐高糖培养基(含0.7%
2、氯化钠和1%葡萄糖的线虫NGM培养基),然后向黄连素干预组中加入相应浓度的黄连素溶液,培养6 d。于第1、3、6天测定各组线虫体长、体宽及寿命,培养第6天采用RT-qPCR法检测线虫类似人胰岛素代谢相关基因daf-2、daf-16 mRNA。结果与正常对照组相比,高盐、高糖以及高盐高糖组线虫体宽增加、寿命缩短(P 均0.05),daf-2 mRNA表达升高、daf-16 mRNA表达降低(P均0.05);与高盐、高糖以及高盐高糖组相比,添加黄连素组线虫的体宽降低、寿命延长(P均0.05),daf-2 mRNA表达降低、daf-16 mRNA表达升高(P均0.05)。结论黄连素可抑制高盐高糖诱发
3、的秀丽线虫形态改变以及寿命缩短,其机制可能是通过下调daf-2 mRNA表达、上调daf-16 mRNA表达来发挥作用。关键词:黄连素;秀丽隐杆线虫;高盐;高糖;线虫形态;线虫寿命;daf-2;daf-16doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2023.26.008 中图分类号:R151 文献标志码:A 文章编号:1002-266X(2023)26-0035-05Intervention effects of berberine on morphological and lifespan changes of Caenorhabditis elegans induced b
4、y high-salt and high-sugar dietXU Xiao,LU Tao,LI Ke,XU Jianing,LIU Xiaoyu,DU Pengyun,ZHANG ChenggangSchool of Life Sciences,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 102488,ChinaAbstract:Objective To explore the intervention effect of berberine on changes of morphology and lifespan of Caenorhab
5、ditis elegans(C.elegans)induced by high-salt and high-sugar diet.Methods C.elegans were cultured and randomly divided into the normal control group,high-salt group,high-sugar group and high-salt-high-sugar group.The normal control group was added with nematode NGM medium.In the high-salt group,high-
6、sugar group,and high-salt-high-sugar group,we set up the model control group,10 mg/L berberine intervention group,and 20 mg/L berberine intervention group,which were first added with high-salt medium(nematode NGM medium containing 0.7%sodium chloride),high-sugar medium(nematode NGM medium containing
7、 1%glucose),and high-salt-high-sugar medium(nematode NGM medium containing 0.7%sodium chloride and 1%glucose),respectively,and then the berberine intervention group was added with corresponding concentrations of berberine solution,and cultured for 6 days.The body length,body width of C.elegans were
8、measured on the 1st,3rd and 6th days,the lifespan of C.elegans were measured and daf-2 and daf-16 mRNA levels were detected by RT-qPCR on the 6th day of culture.Results Compared with the normal control group,the high-salt,high-sugar and high-salt-high-sugar groups had significant increase in body wi
9、dth and significant reduction in lifespan(all P0.05);the expression of daf-2 mRNA increased and daf-16 mRNA decreased(all P0.05).Compared with the high-salt,high-sugar and high-salt-high-sugar groups,berberine supplementation significantly reduced body width and prolonged life span(all P0.05);the ex
10、pression of daf-2 mRNA significantly decreased and daf-16 mRNA significantly in基金项目:地方病与少数民族疾病教育部重点实验室(贵州医科大学)开放项目(FZSW-2021-002)。第一作者简介:徐婋(1998-),女,硕士研究生在读,主要研究方向为中药的作用及机制。E-mail:通信作者简介:张成岗(1970-),男,研究员,博士研究生,主要研究方向为中医药与肠道菌群。E-mail:开放科学(资源服务)标识码(OSID)35山东医药2023 年第 63 卷第 26 期creased(all P0.05).Concl
11、usion Berberine can reduce the morphological changes and lifespan shortening of C.elegans induced by high-salt and high-sugar diet probably by down-regulating the expression of daf-2 mRNA and up-regulating the expression level of daf-16 mRNA.Key words:berberine;Caenorhabditis elegans;high-salt;high-
12、sugar;morphology of Caenorhabditis elegans;lifespan of Caenorhabditis elegans;daf-2;daf-16食盐和糖在提供能量、维持生命基本活动和健康维护中起重要作用。WHO推荐,成年人每天摄入食盐不超过5 g、糖不超过25 g。调查显示,中国北方地区居民平均每日食盐摄入量为11.2 g,南方地区居民为 10.2 g1;我国 9省(广西壮族自治区、贵州、湖南、湖北、江苏、河南、山东、辽宁和黑龙江)平均每日糖摄入量为 31.3 g2,明显超过 WHO 推荐量。糖摄入过量会引发胰岛素抵抗、慢性血管病、肾功能损害以及心血管疾病3
13、-4;食盐摄入过量则是高血压、心脏病等心血管疾病、脂肪肝、痴呆、慢性肾脏病和中风的危险因素5-6。长期高盐高糖饮食与肥胖的发生密切相关,在摄入糖和盐的过程中,大脑分泌大量阿片类物质以及多巴胺,阿片类物质与成瘾性有关,多巴胺使人产生愉悦感;并且糖和盐会降低乙酰胆碱的释放,从而降低饱腹感,容易诱发暴食。肥胖对人体的呼吸系统、心血管系统、内分泌系统以及免疫系统都会产生不良影响,从而缩短人的寿命;对儿童及青少年来说,肥胖还会影响生长发育和心理状态。因此,减少人们对盐和糖的摄取从而控制肥胖的发生率势在必行。黄连素又称小檗碱,是我国传统中药黄连的主要有效成分,是一种天然的季铵类异喹啉生物碱,目前在临床上已
14、被广泛用于与盐、糖代谢相关疾病的治疗中,在应用磺脲类及二甲双胍等治疗2型糖尿病药物时添加黄连素可进一步提高治疗效果7-8。线虫daf-2基因是人胰岛素受体蛋白相关基因的同源基因,daf-16基因为其下游基因。2022年8月2023年4月,我们以秀丽线虫建立高盐高糖饮食模型,探讨黄连素对高盐高糖诱导的秀丽线虫形态及寿命改变的干预作用,检测其对线虫daf-2、daf-16基因表达的影响,旨在为临床使用黄连素缓解和纠正人体因高盐高糖饮食导致的肥胖和寿命缩短提供参考依据。1 材料与方法 1.1材料野生型 N2 秀丽隐杆线虫、大肠杆菌OP50由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所提供。黄
15、连素为麦克林公司产品。琼脂粉(北京奥博星生物技术有限责任公司),蛋白胨(美国赛默飞公司),氯化钠(天津市大茂化学试剂厂),葡萄糖水合物(天津市光复科技发展有限公司),氢氧化钠溶液(国家化学试剂质检中心),M9盐溶液(10,pH7.4),恒温生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司),体视显微镜(广州市明美光电技术有限公司)。1.2线虫的基本培养将线虫放置于涂布有大肠杆菌OP50的培养基上,置于20 恒温生化培养箱培养。每34 d切胶转板1次,以保证线虫有足够的食物和生活空间,同时注意保持培养基洁净。实验开始前将线虫进行同步化处理,培养至L1期(相当于人类3岁)用于后续实验。1.3高盐和高糖培养基的
16、配制高盐培养基:正常线虫NGM培养基中氯化钠浓度为0.3%,根据我国居民食盐摄入超标倍数,设置氯化钠浓度为0.7%。向50 mL线虫NGM培养基中添入0.35 g氯化钠,配制成氯化钠浓度为0.7%的培养基。高糖培养基:向50 mL线虫NGM培养基中加入0.5 g葡萄糖水合物,配制成葡萄糖浓度为1%的培养基9。高盐高糖培养基:向50 mL线虫NGM培养基中添加0.5 g葡萄糖水合物和0.35 g氯化钠,配制成葡萄糖含量为1%、氯化钠含量为0.7%的培养基。1.4实验组黄连素干预浓度的确定以 M9盐溶液为溶剂配制0、1、10、20、50 mg/L黄连素溶液。每个浓度设置3个60 mm直径线虫NGM
17、培养皿,加入0.2 mL对应浓度的黄连素溶液,培养 10 d,计算总存活率。结果显示,与 0 mg/L 黄连素比较,1、10、20 mg/L黄连素干预下的线虫总存活率无统计学差异,50 mg/L黄连素干预下的线虫总存活率降低,故后续实验选择黄连素浓度10 mg/L和20 mg/L。1.5线虫分组与干预方法将线虫分为正常对照组、高盐组、高糖组、高盐高糖组。正常对照组加入线虫NGM培养基;高盐组、高糖组、高盐高糖组下设模型对照组、10 mg/L黄连素干预组、20 mg/L黄连素干预组,先分别加入高盐培养基、高糖培养基、高盐高糖培养基,然后向黄连素干预组中加入相应浓度的黄连素溶液。使用直径60 mm
18、的培养皿,置于20 恒温培养箱中培养。1.6线虫生长指标观察于培养第1、3、6天,每组随机选取30条线虫,在体视显微镜下进行观察。使用 MShot Image Analysis System 显微测量软件截取36山东医药2023 年第 63 卷第 26 期线虫图片,使用Image J图像处理软件测定线虫体长和体宽(虫体中部最宽部分),以像素(pixels)作为单位,1 mm=(436.47 0.15)pixels。1.7线虫寿命统计每组随机选取30条线虫,于20 恒温培养箱中培养,每2 d将线虫挑至新的培养基,直至线虫全部死亡。记录30条线虫的寿命,取平均数。1.8线虫daf-2、daf-16
19、 mRNA检测采用RT-qPCR法。培养第6天,每组随机选取30只线虫,加液氮后研磨。采用TRIzol法提取总RNA,测定RNA浓度及纯度后,在37 环境下,逆转录酶催化下合成cDNA。在85 环境下灭活逆转录酶,然后进行PCR扩增。引物序列:daf-2 mRNA 上游引物 5-GTTGATAATGCTGCCGAG-3,下游引物 5-ATCCCGGTCCGATT-TCTT-3;daf-16 mRNA 上游引物 5-ATCGTGTGCTCAGAATCC-3,下游引物:5-ATGAATAGCTGCC-CTCC-3。扩增结束后计算扩增效率,采用2-CT法计算目的基因的相对表达量。每组重复3次。1.9
20、统计学方法采用SPSS17.0统计软件。计量资料以-x s 表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。P0.05);添加 10、20 mg/L黄连素后,高盐组、高糖组以及高盐高糖组体长与对应的未加药线虫相比差异均无统计学意义(P均0.05)。见表1。2.2各组线虫不同时间点体宽比较培养3、6 d时高盐组、高糖组以及高盐高糖组体宽均较对照组增加(P 均0.05);添加 10、20 mg/L 黄连素后,高盐组、高糖组以及高盐高糖组体宽均较对应的未加药线虫减少(P均0.05)。见表2。2.3各组线虫寿命比较高盐、高糖、高盐高糖组寿命均较对照组缩短(P均0.01);添加10
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