黑曲霉发酵制取亚麻籽粕多肽工艺研究.pdf

第1 0 期（总第58 5期）2023年1 0 月文章编号：1 6 7 1-9 6 46（2 0 2 3）1 0 a-0029-04农产品加工Farm Products Processing黑曲霉发酵制取亚麻籽粕多肽工艺研究No.10Oct.张莉莉（黑龙江省农业科学院乡村振兴科技研究所，黑龙江哈尔滨1 50 50 0)摘要：用脱毒（去除生氰糖苷）亚麻籽粕为原料，黑曲霉为发酵菌种，采用微生物发酵方法制备亚麻籽粕多肽，将亚麻籽粕多肽得率作为响应值，通过单因素试验及响应面法对其制备工艺进行优化，并测定其抗氧化活性。结果表明，黑曲霉发酵亚麻籽粕制备亚麻籽粕多肽的最优工艺条件是发酵酶解pH值6.2，接种量6.6 mL，发酵培养温度30.6，发酵时间6 5.6 h，所得其多肽得率为91.7 2%。当样品质量浓度为40 mg/mL时，对DPPH自由基清除率达到79.34%。当样品质量浓度为40 mg/mL时，对ABTS自由基清除率为8 4.1 3%。结果表明，亚麻籽粕多肽具有一定的抗氧化性。关键词：亚麻籽；黑曲霉；发酵；亚麻籽粕多肽；抗氧化性中图分类号：TQ922.9(Institute of Rural Revitalization Science and Technology,Heilongjiang Academy of Agricultural SciencesAbstract:Flaxseed meal polypeptide was prepared from detoxified flaxseed meal and Aspergillus niger by microbialfermentation,and the antioxidant activity were determined.The yield of linseed meal polypeptide was taken as the index,thepH value of fermentation was 6.2,the amount of bacteria added was 6.6 mL,the temperature of fermentation was 30.6,the time of fermentation was 65.6 h,the yield of polypeptide was 91.72%.When the mass concentration of the sample was40 mg/mL,the DPPH radical scavenging rate reached 79.34%.When the mass concentration of the sample was 40 mg/mL,the free radical scavenging rate of ABTS was 84.13%.The results showed that flaxseed meal polypeptides had certainantioxidant activity.Key words:flaxseed meal;Aspergillus niger;ferment;flaxseed meal polypeptide;antioxidant activity文献标志码：AStudy on the Preparation of Flaxseed Meal Polypeptideby Aspergillus niger FermentationHarbin,Heilongjiang 150500,China)doi:10.16693/ki.1671-9646(x).2023.10.007ZHANG Lili钙流失等。现阶段，关于亚麻籽粕多肽的研究，大0引言部分使用酶解的方法，目前并未见通过微生物发酵亚麻籽粕多肽是指亚麻籽粕蛋白质经过水解分方法制作亚麻籽粕多肽的报道。离精制等过程而获得的通常由3 6 个氨基酸组成的以脱毒亚麻籽粕为原料，利用黑曲霉发酵来获相对分子量小于1 0 0 0 Da的低肽混合物。与蛋白质得亚麻籽多肽，以单因素试验为基础，通过响应面相比，亚麻籽粕多肽除了富有营养、易吸收外，还试验得到制备亚麻籽粕多肽的优化工艺，并测定其具有抗氧化、抗菌、降糖等功效2。亚麻籽粕是亚麻对 DPPH自由基和 ABTS 自由基的清除能力。为提高籽经溶剂浸提或机械压榨取油后的残留物，一般作亚麻籽的利用价值和多肽活性产品的研究提供相为动物饲料或废物处理，利用率低，然而其蛋白含应的理论基础和工艺指导。量高达40%50%，氨基酸丰富，蛋白组成中不含有1材料与方法谷蛋白，这就为谷蛋白过敏者提供了一个蛋白替代品种 3。除蛋白含量高外，亚麻籽粕还含有0.7%左右的木粉素!。亚麻木酚素对很多疾病都起到防治作用，如女性乳腺疾病、经期疼痛、男性前列腺疾病、收稿日期：2 0 2 2-0 8-1 0作者简介：张莉莉（1 98 2 一），女，硕士，助理研究员，研究方向为农产品加工及微生物发酵。1.1材料黑曲霉As3.739，购自北京北纳创联生物技术研究院。30脱毒亚麻籽粕，黑龙江省兰西县汇源植物油有限公司提供。1.2试剂1.2.110.05mol/L磷酸二氢钠溶液（pH值2.5）1 L的配制方法城区无水磷酸二氢钠1 2 0 0.2=6 g，溶于无菌水定容至1 L，再用磷酸调pH值至2.51。1.2.210%乙腈（色谱纯）50 0 mL的配制方法将50 mL的乙和450 mL的纯净水混匀，配制成50 0 mL的1 0%乙腈溶液 7。1.2.310%TCA（三氯乙酸）溶液1 0 0 mL的配制方法准确量取50 0 gTCA试剂放入试剂瓶中加入100mL纯净水，磁力搅拌至完全溶解1 8 。1.2.4改良马丁培养基蛋白陈5.0 g，磷酸氢二钾1.0 g，酵母浸出粉2.0g，硫酸镁0.5g，葡萄糖2 0.0 g，水1 0 0 0 mL。除葡萄糖外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH值约为6.8，煮沸，加人葡萄糖溶解后，摇匀，纱布滤清，调节pH值使灭菌后为6.40.2，分装，灭菌，备用。1.3仪器设备恒温振荡培养箱、超净工作台、精密pH计、紫外可见分光光度计、高速冷冻离心机、半自动凯氏定氮仪等。1.4试验方法1.4.1菌种的活化与菌悬液的制备将活化后的菌液划线到改良马丁琼脂斜面上，静置培养6 7 d（2 3 2 8 下培养）0，然后接种于三角瓶进行扩大培养，然后将活化好的黑曲霉在无杂菌的情况下用无菌生理盐水洗下孢子，并将其浓度调整为1 0 8 个/mL。1.4.2亚麻籽粘多肽萃取方法将灭菌后的发酵液离心分离取上清液，上清液中加人等体积的TCA，50 水浴下振荡30 min，以转速50 0 0 r/min离心分离得上清液，取此上清液过分子量1 0 0 0 Da的滤膜，所得上清液真空冷冻干燥成粉，取适量样品洗人1 0 0 mL容量瓶定容 2，待测。1.4.3亚麻籽粘多肽含量的测定方法高效液相色谱法3。色谱柱：COSMOSILCis色谱柱（2 50 mm4.6mm，5m)；流动相：A为0.05mol/L磷酸二氢钠溶液（用磷酸调pH值至2.5），B为乙腈，梯度洗脱（0 30 min，1 0%40%B）；检测波长2 2 0 nm，体积流量1.0 mL/min，进样量2 0 L，柱温2 5。取供试品溶液各2 0 L，注人液相色谱仪，记录色谱峰面积，换算成质量。1.4.4多肽的抗氧化性在最佳的发酵工艺条件下，对亚麻籽粕进行发酵，将发酵后得到的发酵液进行冷冻干燥处理。农产品加工将冻干后的样品制成ABTS溶液和DPPH溶液 4,并对溶液中的大豆多肽粗提物的抗氧化活性进行测定。1.4.5发酵亚麻籽粕多肽工艺优化将亚麻籽粕酶解液接种黑曲霉，并在确定的条件下进行发酵，将接种量（2%，4%，6%，8%，10%）、p H 值（4，5，6，7，8）、发酵时间（36,48，6 0，7 2，8 4h）、发酵温度（2 4，2 6，2 8，30，32）作为影响因素研究其对多肽得率的影响。以单因素试验为基础，多肽得率（Y）作为指标，确定接种量（X）、p H 值（X2）、发酵温度(X3）、发酵时间（X）为影响因素，通过响应面法来对试验进行优化，优化发酵工艺。因素水平编码见表1。表1 因素水平编码水平X接种量/%X2pH值X,发酵温度0/X4发酵时间t/h-22-1406182101.4.6数据处理运用SAS9.01软件进行数据分析。2结果与分析2.1单因素试验2.1.1接种量对多肽得率的影响接种量对多肽得率的影响见图1。100%/率散多2图1 接种量对多肽得率的影响由图1 可知，随着接种量的增加，多肽得率呈先增加后降低的趋势。其原因可能是开始时接种量低，蛋白酶产生的量较少，亚麻籽中的蛋白不能充分分解，因此多肽得率低；随着接种量的不断增加，蛋白酶产生的较多，多肽得率渐渐升高；当接种量过高时，由于溶液中有限的营养物质黑曲霉的生长受到抑制，多肽得率下降。2.1.2溶液pH值对多肽得率的影响溶液pH值对多肽得率的影响见图2。由图2 可知，由于pH值的不断增加，多肽得率先上升后下降。其原因可能是，黑曲霉发酵过程中2023年第1 0 期42452662873083246接种量/%36486072848102023年第1 0 期100%/率多04图2 溶液pH值对多肽得率的影响有最适pH值，培养液中的pH值过高或者过低，都会抑制黑曲霉的生长，因此过高或者过低的pH值，多肽得率都会下降。2.1.3发酵温度对多肽得率的影响发酵温度对多肽得率的影响见图3。100%/率韵多24图3发酵温度对多肽得率的影响由图3可知，由于发酵温度的不断增加，多肽得率先上升后降低。温度较低时，黑曲霉生长速度缓慢，多肽得率较低，随着发酵温度的升高，黑曲霉生长速度加快，多肽得率升高，当发酵温度过高时，会抑制黑曲霉的生长，使得多肽得率下降。2.1.4发酵时间对多肽得率的影响发酵时间对多肽得率的影响见图4。100%/率能多10036图4发酵时间对多肽得率的影响由图4可知，由于发酵时间的延长，多肽得率先上升后下降。造成这种趋势的原因可能是发酵初期黑曲霉生长缓慢，多肽得率较低，随着发酵时间延长，黑曲霉生长速度趋于平稳，多肽得率增加。发酵时间继续延长，产生了较多的代谢废物，酶合成受到影响，多肽得率下降。2.2响应面试验以单因素试验为基础，多肽得率（Y）作为最终指标，以接种量（X）、p H 值（X）、发酵温度张莉莉：黑曲霉发酵制取亚麻籽粕多肽工艺研究(X）、发酵时间（X）作为影响因素，通过响应面试验优化发酵工艺。试验方案及试验结果见表2，多肽得率的回归与方差分析结果见表3。表2 试验方案及试验结果试验号XI56pH值2628发酵温度/4860发酵时间t/h31：X2X7830327284X41-12-13-14-15-16-17-18-19110111112113114115116117-2182190200210220230240250260270280290300310320330340350360由表2 可知，通过SAS9.01软件进行数据分析，建立脱胶率的二次响应面回归模型为：Y=93.016 67+1.179X,+0.812X2-0.029X3+1.595X4-1.042X?-1.893X,X2+1.618X,X3-0.406X,X4-1.567X2+0.068X2X3-0.006X2X4-0.692X,2-0.918X,X4-1.055X?2.由表3可知，回归模型p值为0.0 0 0 1，回归项极显著（p0.01），失拟项不显著，且模型R=92.30%，R2Ag=87.17%，由方差分析结构可看出，回归方程与得到的试验结果有较好拟合，线性关系显著。2.3验证试验通过响应面优化试验得到的结果可知，最佳的多肽得率/%-1-1-1-1-11-111-11-11111-1-1-1-1-11-111-11-111110000-20200-2020000000000000000000000000000-11-11-11-11-11-11-11-11000000-2200000000000082.388.781.984.590.595.286.289.888.293.191.992.184.990.391.992.287.588.985.886.489.190.185.690.793.393.193.592.593.292.692.993.193.592.593.192.932方差来源平方和自由度XI1X21X31X41XiXi1XiX21XiX,1XX41X2X21X2X,1X2X41XX31XX41X4X41回归14390.308 100剩余21失拟10误差11总和35422.855600注：*表示差异显著（p0.05)；“*表示差异极显著（p0.01)。发酵工艺条件为pH值6.2，接种量6.6%，发酵温度30.6，发酵时间6 5.6 h，其多肽得率为91.7 2%。考虑到试验的可行性操作，设定接种量6.5%，pH值为6.0，发酵温度为30，发酵时间为6 5h，通过验证，多肽得率为8 9.91%，实际的验证值与优化的预测值比较接近。2.4亚麻籽粕多肽抗氧化能力测定多肽样品对DPPH自由基（a）和ABTS自由基(b）的清除率见图5。当亚麻籽粕多肽样品的质量浓度为0 1 0 mg/mL时，DPPH自由基的清除率呈现显著上升的趋势；当多肽样品质量浓度大于2 0 mg/mL时，样品对DPPH自由基的清除率趋于平衡；当样品的质量浓度达到40mg/mL时，样品对DPPH自由基的清除率可以达到7 9.34%。当多肽样品质量浓度在0 1 0 mg/mL范围内增加时，样品对ABTS自由基的清除率呈现显著上升的趋势；当样品的质量浓度大于2 0 mg/mL时，ABTS自由基的清除率逐渐升高；当样品的质量浓度为40 mg/mL时，ABTS自由基的清除率为8 4.1 3%。说明样品对DPPH自由基和ABTS自由基均具有一定清除能力。3结论通过数据分析得出最优发酵工艺参数为酶解pH值6.2，接种量6.6 mL，发酵温度2 7.6，发酵时间6 5.6 h，多肽得率的预测值为91.7 2%。采用上述优化的工艺条件进行验证试验，其多肽得率为89.91%，误差小于5%，与理论预测值差别不大。在样品质量浓度为40 mg/mL时，对DPPH自由基清除农产品加工表3多肽得率的回归与方差分析结果均方F值33.370 42033.370 42015.84375015.84375010.222.5600.020 4170.0204170.013.1730.909 71561.12042061.120 42034.791 70034.791 70057.380 63057.380 63041.925 63041.925 6302.640 6252.640 62578.646 70078.646 7000.075 6250.075 6250.000 6250.000 62515.355 03015.355 03013.505 63013.505 63035.63087035.630 87027.87915017.9879300.000 100*32.5475001.549.88131.210 8303.121 08325.684 7300.213 1701.336 6670.1215152023年第1 0 期%/率塑影清甲月100880P值21.5309500.000 141*0.004 331*39.435.5600.000 100*22.4479800.000 112*37.022 6000.000 100*27.0508700.000 100*1.703.7600.205 91850.743.7000.000 100*0.048 7940.827 3090.000.4030.9841689.907 2350.004 859*8.713.9760.007 612*22.9894200.000 100*60504030Hdd201000%/率塑清甲月10038860504030201000图5多肽样品对DPPH自由基（a）和ABTS自由基（b）的清除率率达到7 9.34%；在样品质量浓度为40 mg/mL时，对ABTS自由基清除率为8 4.1 3%。结果表明，亚麻籽多肽具有一定的抗氧化性。参考文献：1 孙婕，尹国友，QiWang，等.黑曲霉液态发酵韭籽提取韭籽多肽工艺 J】：食品工业科技，2 0 1 7，38（5）：199-204,209.2 谢翠品，敬思群，刘帅，等.黑曲霉发酵核桃粕生产核桃多肽工艺优化】.中国酿造，2 0 1 3（2)：53-57.3 邹演，蔡永敏，胡炜东。亚麻籽粕制备多肽饮料的研究.食品工业，2 0 1 7（1 1)：1 49-1 51.4张文敏，张健，周浩纯，等.亚麻籽粕制备小分子抗氧化活性肽.食品科学，2 0 2 0，41（8)：36-44.5 洪晶，王惠敏，蔡甜甜，等。一种亚麻籽粕抗氧化六肽及其制备方法与应用：中国，CN108191958AP2018.6 马诗文，高云，宗洪凤，等.绿豆多肽饮料的制备及抗氧化活性研究。辽宁科技大学学报，2 0 1 9（5)：440-447.7陈颖璐.亚麻种子中降糖多肽的分离纯化及性质研究D.太原：山西大学，2 0 1 7.8李次力，缪铭.亚麻籽粕不同脱毒方法的比较研究 食品科学，2 0 0 6，2 7（1 2)：2 8 0-2 8 2.9Pongsak Rattanachaikunsopon,Parichat Phumkhachorn.Po-tential of chinese chive oil as a natural antimicrobial forcontrolling flavor bacterium columnare infection in nile tilapiaoreochromis niloticus .Fisheries Science,2009(75):1 4311 437.10 Tang Wenjun,Xia Jianye,Chu Ju,et al.Development andapplication of morphological analysis method in aspergllus（下转第39页）11020样品质量浓度/mgmL-l(a)1020样品质量浓度/mgmL-1(b)303040402023年第1 0 期合果冻制作工艺进行优化，橙子西蓝花复合果冻制作工艺流程为原料预处理、制备复合果蔬汁、溶胶及煮胶、灌装灭菌及冷却。橙子西蓝花复合果冻的最佳配方工艺为复合胶添加量1.42%，复合胶（卡拉胶：黄原胶）配比为1 0：1，复合果蔬汁添加量29.8%，白砂糖添加量9.8 8%，柠檬酸添加量0.1 0%，在该配方下制得橙子西蓝花复合果冻橙子味与西蓝花味浓郁，酸甜可口，口感润滑，细腻，有弹性，pH值为5.7，可溶性固形物含量为1 5.3%，弹性为4.59mm，硬度为4.6 0 3N，咀嚼性为8.8 1 mJ，其品质检测均符合国家标准，具有较好的市场前景。参考文献：1 张睿涵，杨国翠，沈伊婷，等.果冻制作工艺的研究.科技风，2 0 2 0(2 5)：1 9 7-1 9 8.2刘雨齐，赖俊汶，王颖，等.我国果冻的研究进展 J。现代食品，2 0 2 1（1 5)：7-1 1，1 4.3 Singh R P,Tingirikari J M R.Agro waste derived pectinpoly and oligosaccharides:Synthesis and functional charac-terization J.Biocatalysis and Agricultural Biotechnology,2021(31):101 910.4田华，黄珍.保健果冻研究现状与展望 食品研究与开发，2 0 1 9，40(4)：2 1 5-2 1 9.5 马诗琪，周宇昕，王诗伟，等.保健果冻的研究进展.科技风，2 0 2 1 (2 3)：1 1 7-1 2 0.6李丹，邓仕彬，刘涛，等.橙子番茄混合果酒带渣主发酵工艺优化 食品研究与开发，2 0 2 1，42（2 3）：32-36.7Honore Patrick M.High-dose vitamin C:How an orange canbe a lemon J.Critical Care Medicine,2022,50(9):719-720.8洪姣，王佳蕊，黄春琦，等.西蓝花预防和治疗肿瘤研究的新进展】肿瘤药学，2 0 1 4（6)：40 5-40 9.9韩芯怡，等：响应面法优化橙子西蓝花复合果冻加工工艺Kaiser A E,Baniasadi M,Giansiracusa D,et al.Sul-39foraphane:A 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