胡杨PeERF1基因提高转基因银腺杨84K耐旱性研究.pdf
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1、DOI:10.12403/j.1001-1498.20220604胡杨PeERF1基因提高转基因银腺杨 84K耐旱性研究葛晓兰1,2,杜久军1,张磊1,3,曲冠证2,胡建军1,3*(1.中国林业科学研究院林业研究所,林木遗传育种全国重点实验室,国家林业和草原局林木培育重点实验室北京100091;2.东北林业大学林学院,林木遗传育种全国重点实验室黑龙江哈尔滨150006;3.南京林业大学,南方现代林业协同创新中心江苏南京210037)摘要:目的 分析 PeERF1 基因在胡杨干旱胁迫下的作用和 PeERF1 转基因植株抗旱的生理适应机制,为进一步研究该基因在木本植物中的抗旱调控机制奠定基础。方法
2、 以胡杨为材料进行 20%PEG6000 模拟干旱(0、12 和 24h)处理,对胡杨 PeERF1 基因进行时空表达模式分析。以非转基因(WT)、过表达35S:PeERF1 转基因植株(PE)、显性抑制 35S:PeERF1-SRDX 转基因植株(SE)为试验材料,采用不同浓度 PEG6000(对照组,20%)处理 WT、PE 和 SE 模拟干旱胁迫,并对其进行表达模式、生长性状和生理指标分析。结果 研究结果表明 PeERF1 基因在胡杨叶中的表达水平最高,其次是茎和根。在正常状态下,转基因植株和 WT 生长性状、叶绿素含量、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和过氧化物酶(POD)含量变
3、化不大。在 20%PEG6000 处理后,PE 转基因植株比 WT 表现出更好的生长状态,PE 转基因植株的叶绿素含量、CAT 和 POD 含量高于 WT,PE 转基因植株 MDA 含量低于 WT。而 SE 转基因植株则表现出相反的性状。结论 本研究结果初步显示干旱胁迫下,PeERF1 基因转基因植株生长状态、叶绿素含量、过氧化氢酶、丙二醛和过氧化物酶等相关生理指标均发现显著变化。PeERF1 对转基因杨树响应干旱起到了正向调控的作用。关键词:银腺杨;转基因;干旱胁迫;生长性状;生理指标中图分类号:S792.11文献标识码:A文章编号:1001-1498(2023)05-0083-08干旱是植
4、物生长、发育和生产力的主要环境制约因素。由于林木寿命长,难以大规模灌溉,干旱极大地降低了许多森林生态系统的树木生产力和存活率1。因此,加快对林木抗旱机制的剖析,提高林木对干旱的适应能力,是干旱土地利用、环境可持续性和提高经济效益的迫切需要。为了适应干旱胁迫,植物已经进化出复杂的机制来感知外部信号,并通过调节基因的表达来协调代谢途径和形态特征2。AP2/ERF 家族转录因子调控植物的多种发育过程,在激素调控和逆境应答中发挥重要作用3。AP2/ERF 家族转录因子在高等植物中调控多种环境胁迫响应过程,如非生物胁迫(冷、热、旱、盐、渗透胁迫)和生物胁迫(食草昆虫和微生物病原体)4-8。此外,许多研究
5、表明,过表达 AP2/ERF 家族转录因子的转基因植物对非生物和生物胁迫的耐受性有所提高9-11。例如,对 ERF76 转基因杨树(Populus simonii Populus nigra)转录组测序中发现有 16 个上调转录因子基因和 45 个胁迫相关基因的表达,提高了 ABA(脱落酸)和GA(赤霉素)的生物合成能力,从而增强了杨树对盐胁迫的耐受性12。新疆杨(Populus albavar.收稿日期:2022-12-12修回日期:2023-05-31基金项目:农业生物育种重大项目(2022ZD0401501);国家重点研发计划(2021YFD2200201);国家自然科学基金(32071
6、797)*通讯作者:胡建军,博士,研究员,主要研究方向:林木分子育种,E-mail:林业科学研究2023,36(5):83-90Forest Researchhttp:/pyramidalisBunge)PalERF109 的过表达增强了杨树的耐盐性,进一步的分析表明,PalERF109直接上调了一个高亲和力 K+转运体(HKT)基因PalHKT1;2。表 明 PalERF109 通 过 直 接 激 活PalHKT1;2 增强了耐盐性,并扩展了对 ERF 基因在树木胁迫反应中的作用的理解13。在盐和干旱胁迫 下 转 基 因 ERF38 过 表 达 杨 树 过 氧 化 物 酶(Peroxidas
7、e,POD)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)、可溶性蛋白含量和脯氨酸含量显著增加,表明 ERF38 基因的过表达可以提高转基因杨树的耐盐和渗透性14。胡杨(Populus euphraticaOliv.)是分布于我国西北沙漠地区沙漠河岸森林的优势树种,在维持当地沙漠生态系统方面发挥着重要的作用15。由于其对极端恶劣环境的良好适应性,胡杨被认为是木本植物非生物胁迫耐受机制研究的典型模式物种16。前期通过对胡杨种子耐盐全基因组关联分析(Genome wide association study,GWAS)和转录组分析中获得胡杨 PeERF1 基因17,通过亚细胞定
8、位实验发现 PeERF1 为核定位蛋白,转录自激活实验证明 PeERF1 基因具有转录自激活活性。耐盐能力分析试验证明胡杨 PeERF1 基因能够增加转基因植株的耐盐性18,但其耐旱机制中的作用尚缺乏研究。本研究为探明胡杨 PeERF1 基因应答干旱胁迫的表达特点,以胡杨为材料研究PeERF1 基因在模拟干旱胁迫(PEG)下不同组织 的 时 空 表 达 模 式。通 过 对 野 生 型 银 腺 杨(Populus alba P.glandulosa 84k,84K杨)、转 PeERF1 基因过表达和抑制表达银腺杨进行模拟干旱胁迫,观察 PeERF1 基因在模拟干旱胁迫下表达模式、表型和生理指标的
9、变化,为进一步探究 该 基 因 在 植 物 抗 逆 中 的 功 能 提 供 依 据。1研究方法1.1试验材料本 试 验 以 胡 杨 野 生 型、84K 杨(WT)、35S:PeERF1 过 表 达(PE)和 35S:PeERF1-SRDX 抑制表达(SE)转基因银腺杨为材料,35S:PeERF1 是通过 35S 强启动子与 PeERF1的 cDNA 融合构建的载体转化 84K 杨获得的转基因植株,该转化载体可以使目标基因过表达。35S:PeERF1-SRDX 是由编码 SRDX 肽的核酸序列与 PeERF1 的 cDNA 融合构建的载体转化 84K杨获得的转基因植株,该转化载体可以特异性抑制目
10、标基因的表达,转基因植株由前期研究获得18。转基因组培苗保存于中国林业科学研究院林木遗传育种全国重点实验室,在含有约 70mL 生根培养基的培养瓶中生长,培养条件为光照强度 60008000lx、光照/黑暗周期 16h/8h、平均温度 25、相对湿度 60%70。1.2试验方法1.2.1模拟干旱胁迫处理本试验在中国林业科学研究院科研温室中进行,84K 杨组培苗在组培室生长 1 个月后,选择生长状态一致且健壮的组培苗移栽(花盆规格:盆高盆口直径=22cm20cm),基质为草炭土珍珠岩=31。在土培 1 个月后选取生长状态一致且健壮的植株进行模拟干旱处理试验。胡杨组培苗干旱处理,将在组培室生长 1
11、 个月且 生 长 状 态 一 致 的 胡 杨 幼 苗 转 移 到 20%的PEG6000 溶液中,在处理的 0、12 和 24h 时取根、茎和叶投入液氮后保存80 冰箱备用,每个处理 3 次重复,每个重复 3 株,每个处理共 9 棵植株。转 PeERF1 基因 84K 杨干旱处理,选择转基因 PeERF1 基因过表达(PE1、PE2)和抑制表达(SE1、SE2)高表达的各两个株系,以及野生型(WT)试验材料进行模拟干旱胁迫试验,平均分为6 组,每组每个株系3 株,3 组用于20%PEG6000处理 7d,另外 3 组为水处理作对照。处理后取叶片投入液氮后保存于80 冰箱备用,每个处理包含 9
12、棵植株。1.2.2生物量测定处理结束时随机选取各处理各株系 6 株,测量植株茎基部到茎尖部分为自然株高,株高数据以 cm 为单位,保留一位小数。取植株地上部分,并用清水、蒸馏水、超纯水依次清洗一遍,擦干水分后,用万分之一天平测定植株鲜质量。1.2.3叶绿素含量测定对 84K 杨和转 PeERF1基因植株进行干旱胁迫处理 7d,取顶端第 2 片新鲜叶片用于叶绿素含量的测定。用乙醇法对转基因植株进行叶绿素含量测定19。1.2.4过氧化氢(CAT)、丙二醛(MDA)和过氧化物酶(POD)含量测定取 84K 杨和转84林业科学研究第36卷PeERF1 基因植株干旱处理 7d 后由上而下第 3、4 和
13、5 片叶子测定过氧化氢(Catalase,CAT)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和过氧化物酶(Peroxidedismutase,POD)含量。具体操作步骤如下:液氮研磨后,取 0.1g 样品,加入 1mL提取液,进行冰浴匀浆:8000g,4 离心10min,取上清,置冰上待测。采用索莱宝公司过氧化氢CAT 活性试剂盒20、丙二醛 MDA 活性试剂盒21、过氧化物酶 POD 活性试剂盒22分别进行 CAT 含量、MDA 含量和 POD 含量测定。1.3数据处理与统计分析根据采用 2CT法获得 qPCR 的差异表达倍数23。利用 Excel2018 软件将所测得的数据进行成组
14、数据检验统计分析。本研究中各项指标测定时,测定值重复 3 次后,用 Excel 表格和 Prism8软件进行分析,组间比较用 t 值,当*p0.05 时,差异显著;*p0.01 时,差异极显著。2结果与分析2.1干旱胁迫下胡杨PeERF1表达模式分析为了研究 PeERF1 在不同组织中的表达模式,我们采用 qRT-PCR 方法分别检测了其在叶、茎和根中的表达水平。结果表明,PeERF1 在胡杨叶、茎和根等不同组织中均有表达(图 1A),叶中的表达水平最高,其次是茎和根,其中叶中的表达量是茎的 1.2 倍,是根的 1.24 倍。叶Leaf相对表达量Relative expression leve
15、l茎Steam根Root0 h叶Leaf12 h24 h1.5A1.00.5054B3210abb*0 h茎Steam12 h24 h108C6420*0 h根Root12 h24 h1.51.0D0.50*20%PEG stress20%PEG 处理20%PEG stress20%PEG 处理20%PEG stress20%PEG 处理注:A:PeERF1 在胡杨不同组织中的表达量,不同的小写字母表示有显著性差异(P0.05);BD:PeERF1 在胡杨不同组织中对干旱响应的表达分析,*p0.05 时,差异显著,*p0.01 时,差异极显著Notes:A:TheexpressionofPeE
16、RF1indifferenttissuesofPopulus euphratica.Significantdifferences(P0.05)areindicatedbydifferentlowercaseletters.B-D:PeERF1expressionanalysisofdroughtresponseindifferenttissuesofP.euphratica.*p0.05,thedifferenceissignificant.*p0.01,thedifferenceisextremelysignificant图1PeERF1的时空表达模式分析Fig.1Analysisofspa
17、tiotemporalexpressionpatternofPeERF1为了研究 PeERF1 在胡杨不同组织干旱胁迫下的时空表达模式,利用 qRT-PCR 技术检测了20%PEG6000 处理0、12 和24h 后PeERF1 在叶、茎和根中的表达水平,如图 1BD 所示,PeERF1基因在胡杨叶片中表达量在干旱胁迫在反应初期(12h)呈上调趋势,在处理 24h 出现下调趋势。而在茎和根中则表现出先下降后上升的趋势。综上可知,当胡杨受到干旱胁迫后 12、24h 时,PeERF1 基因均有不同表达,表明 PeERF1 基因参与植物干旱胁迫的调节过程。2.2干旱胁迫下转PeERF1基因 84K
18、杨表达模式分析为了研究干旱胁迫下 84K 杨和转基因 PeERF1植株在不同组织中的表达模式,利用 qRT-PCR 技术检测了 20%PEG6000 处理 7d 后 84K 杨和转基因 PeERF1 植株在叶(图 2A)、茎(图 2B)和根(图 2C)中的表达水平。结果显示,在正常状态和干旱胁迫条件下,转基因株系在根、茎和叶中表达量均高于 WT,且在叶片和茎中表现差异极显著(图 2)。表明 PeERF1 基因在一定程度上能够提高杨树的耐旱性。2.3干旱胁迫对转PeERF1基因 84K 杨生长的影响逆境胁迫严重影响着植物的生长发育,在叶片表型方面表现尤为显著。与对照组相比,在正常生长状态下,WT
19、 和转基因株系的生长形态没有表现第5期葛晓兰,等:胡杨 PeERF1 基因提高转基因银腺杨 84K耐旱性研究85出明显的变化(图 3A)。干旱胁迫后,过表达PE 转基因杨树生长状态稍好,表现出较强的耐旱性,相反 WT 和抑制表达转基因植株 SE 出现枯萎表现出不耐受,SE 转基因株系叶片完全枯萎甚至死亡。SE1ABSE2WTPE1PE2对照Control对照Control3020100株高Plant height/cm*WTPE1PE2SE1SE2C对照Control6420Fresh weight/g*WTPE1PE2SE1SE2鲜质量20%PEG 处理20%PEG 处理20%PEG 处理2
20、0%PEG stress20%PEG stress20%PEG stress注:*p0.05 时,差异显著;*p0.01 时,差异极显著。下同Notes:*p0.05,thedifferenceissignificant;*p0.01,thedifferenceisextremelysignificant.Thesamebelow图3干旱胁迫对转PeERF1基因 84K 杨生长状态的影响Fig.3TheeffectofdroughtstressonthegrowthstateoftransgenicPopulusalbaPopulusglandulosawithPeERF1gene干旱胁迫处理
21、一周后分别对处理组和对照组植株的株高(图 3B)和鲜质量(图 3C)进行测量后发现,与对照处理相比,胁迫后对照(WT)、过表达(PE1、PE2)和抑制表达(SE1、SE2)植株的株高和鲜质量均下降,各株系株高显著下降,分别为对照组的 86.0%、95.6%、94.3%、77.1%和 70.8%,植株鲜质量也有相同趋势,下降呈极显著。由此可知,干旱胁迫会对植株生长量的增加、生物量的积累产生不利影响。与对照 WT 植株相比,转基因植株(SE)各株系在干旱胁迫下受到的不利影响更大,未处理前转基因植株株高和鲜质量变化不明显,将 PeERF1 基因抑制后会导致植对照Control叶Leaf茎Steam根
22、Root相对表达量Relative expression level对照Control对照Control100806040201.51.00.502.0*WTA10064209080706050151050BCPE1PE2SE1SE2*WTPE1PE2SE1SE2*WTPE1PE2SE1SE220%PEG stress20%PEG stress20%PEG处理 20%PEG stress20%PEG处理20%PEG处理注:*p0.05 时,差异显著;*p0.01 时,差异极显著Notes:*p0.05,thedifferenceissignificant;*p0.01,thedifferenc
23、eisextremelysignificant图2干旱胁迫处理转PeERF1基因不同组织部位表达模式分析Fig.2AnalysisontheexpressionpatternsofdifferenttissuesitesofPeERF1transgeniclinesunderdroughtstress86林业科学研究第36卷株的和鲜质量均显著下降,其中株高下降 8.3%和14.7%,鲜质量下降 20.3%和 24.1%,差异均达到极显著水平。以上实验结果表明 PeERF1 基因在耐旱性中起着至关重要的作用。2.4干旱胁迫对转PeERF1基因 84K 杨叶绿素含量和过氧化氢(CAT)含量的影响为
24、了研究干旱胁迫对转 PeERF1 基因植株叶片叶绿素含量的影响,对过表达和抑制表达转基因株系进行叶绿素含量测定(图 4A)。结果显示,在正常状态下,WT 和转基因株系叶绿素含量差异不显著;在干旱胁迫处理后,过表达转基因株系叶绿素含量高于 WT 叶绿素含量,差异极显著;抑制表达转基因株系叶绿素含量低于 WT,且差异极显著。对照Control20%PEG 处理A 806020400叶绿素含量Chlorophyll content/(mgg1)*WTPE1PE2SE1SE2对照Control20%PEG 处理B 150100500过氧化氢酶含量CAT activity/(Umin1g1)*WTPE1
25、PE2SE1SE220%PEG stress20%PEG stress图4干旱胁迫对转PeERF1基因 84K 杨叶片叶绿素含量和过氧化氢酶(CAT)含量的影响Fig.4Effectofdroughtstressonchlorophyllcontentandthecontentofcatalase(CAT)inleavesoftransgeniclines为了研究干旱胁迫对转 PeERF1 基因 84K 杨叶片 CAT 含量的影响,对过表达和抑制表达转基因株系进行过氧化氢(CAT)含量测定(图 4B)。结果显示,在正常状态下,野生型和转基因株系差异不显著;在干旱胁迫处理后,过表达转基因株系高于
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