河西冷凉地区芍药根腐病病原鉴定及室内药剂筛选.pdf
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1、中国农业科技导报,2023,25(10):144-151Journal of Agricultural Science and Technology河西冷凉地区芍药根腐病病原鉴定及室内药剂筛选杨克泽1,吴芳1,2,魏玉杰1,2*,汪亮芳1,常浩1,吴之涛1,2,杨宪忠1,2(1.甘肃省农业工程技术研究院,甘肃省特种药源植物种质创新与安全利用重点实验室,甘肃 武威 733006;2.武威市祁连山区道地中药材生态栽培技术创新中心,甘肃 武威 733006)摘要:近年来,芍药根腐病在甘肃河西冷凉地区发生严重,造成部分植株枯死,极大地影响了芍药产业的发展。为明确河西冷凉地区芍药根腐病的主要致病菌,采用
2、形态学特征和分子生物学方法对该病的病原菌进行鉴定和致病性测定。结果表明,分离的优势菌SY2020-2对芍药具有致病性,根据形态学特征和分子生物学方法综合将其鉴定为尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)。为筛选防治芍药根腐病的高效低毒药剂,选用10种药剂对SY2020-2进行室内毒力测定,结果表明,30%丙硫菌唑的毒力最强,EC50为0.1 mg L1;43%氟菌 肟菌脂、50%多菌灵、10%叶菌唑、20%氟唑菌酰胺和30%肟菌戊唑醇的EC50分别为1.2、2.7、3.5、4.8和6.4 mg L1;25 g L1咯菌腈和3%苯醚甲环唑的毒力相对较差。关键词:芍药根腐病;病原鉴定;毒
3、力测定doi:10.13304/j.nykjdb.2023.0174 中图分类号:S682.1文献标志码:A文章编号:10080864(2023)10014408Pathogen Identification and Laboratory Drug Screening of Peony Root Rot in Cold and Cool Region of HexiYANG Keze1,WU Fang1,2,WEI Yujie1,2*,WANG Liangfang1,CHANG Hao1,WU Zhitao1,2,YANG Xianzhong1,2(1.Key Laboratory of th
4、e Special Medicine Source Plant for Germplasm Innovation and Safety Utilization in Gansu Province,Gansu Academy of Agri-Engineering Technology,Gansu Wuwei 733006,China;2.Wuwei Technology Innovation Center of Genuine Medicinal Materials Ecological Cultivation In Qilian Mountain Area,Gansu Wuwei 73300
5、6,China)Abstract:In recent years,the root rot of Paeonia lactiflora occurred seriously in the cold and cool areas of Hexi,Gansu Province,causing some plants to die,which greatly affected the development of P.lactiflora industry.In order to identify the main pathogenic bacteria of peony root rot in c
6、old and cool areas of Hexi,morphological characteristics and molecular biology methods were used to identify the pathogen and determine the pathogenicity of this strain.The results showed that the dominant strain SY2020-2 was pathogenic to P.lactiflora and was identified as Fusarium oxysporum based
7、on morphological characteristics and hierarchical clustering.In order to screen the effective and low toxicity agents for the prevention and control of peony root rot,10 kinds of agents were selected for virulence analysis.The results showed that 30%propionate had best effect for SY2020-2 with EC50
8、0.1 mg L1,and the EC50 of 43%fluorobacterium oxime lipids,50%carbendazim,10%phyllobacterazole,20%fluxazole amide,30%oxime bacteria amylazol were 1.2,2.7,3.5,4.8 and 6.4 mg L1,25 g L1 fluoxonitrile and 3%phenyloconazole showed poor toxicity.Key words:peony root rot;pathogen identification;virulence a
9、ssay收稿日期:20230310;接受日期:20230815基金项目:财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系建设项目(CARS-21);甘肃省青年科技基金计划项目(21JR7RA752)。联系方式:杨克泽和吴芳为共同第一作者。杨克泽 E-mail:;吴芳 E-mail:*通信作者 魏玉杰 E-mail:10 期杨克泽等:河西冷凉地区芍药根腐病病原鉴定及室内药剂筛选芍药(Paeonia Lactiflora Pall.)是芍药科芍药属著名草本花卉,不仅有极高的观赏价值,而且有非常重要的药用价值。河西冷凉地区因具有独特的地理优势与气候条件,适合种植芍药,主要分布在武威市古浪县古丰镇柳条河与黄
10、羊川镇、金昌等地区。近年来,芍药种植面积逐年增加,市场前景非常广阔。在芍药产业发展过程中,其病虫害问题日益增多,且危害越来越严重,不仅降低了芍药的产量,还严重影响了其观赏价值和药用价值等。目前,河西冷凉地区芍药的主要病害种类有白粉病、根腐病、褐斑病等12,其中根腐病是为害芍药根部最严重的病害3-5。因此,本研究针对河西冷凉地区芍药病害情况展开调查研究,对引起芍药根腐病的病原菌进行分离和形态鉴定,同时开展室内药剂筛选试验,针对芍药病害的病原、发病规律、危害症状进行分析,为河西冷凉地区芍药根腐病的田间防治提供科学依据。1材料与方法1.1试验材料芍药根腐病病株采自甘肃省武威市凉州区黄羊镇新镇路的甘肃
11、省农业工程技术研究院芍药种植基地(N 3767 35,E 10285 32)。3%苯醚甲环唑悬浮剂购自先正达南通作物保护有限公司,30%丙硫菌唑可分散性悬浮剂购自通州先正大农药化工有限公司,24%噻呋酰胺悬浮剂购自北京燕化用生生物有限公司,50%多菌灵可湿性粉剂购自深圳诺普信公司,43%戊唑醇悬浮剂购自上海生农生化制品有限公司,20%氟唑菌酰羟胺悬浮种衣剂购自先正达投资有限公司,43%氟菌肟菌脂悬浮剂购自拜尔有限公司,25 g L1咯菌腈悬浮种衣剂购自先正达南通作物保护有限公司,30%肟菌戊唑醇悬浮剂购自拜尔有限公司,10%叶菌唑悬浮剂购自安徽久易有限公司。1.2试验方法1.2.1芍药根腐病病
12、原菌的分离和致病性测定采集的芍药根腐病病株逐个记录发病症状。采用常规组织分离法6样品中的病原菌进行分离培养,将培养后的菌株稀释纯化进行单孢分离,获得单孢进行纯培养。将在芍药根腐病株中分离到的频率较高的菌落,根据柯赫氏法则7验证分离物的致病性。选择健康芍药植株,栽植前剪去过长的根系,将根部放入0.1%的升汞液中浸泡3 min后取出,用无菌水清洗干净,移栽到装有基质(110 烘箱中高温消毒)的花盆中,浇水后放入设施大棚中缓苗;缓苗后,准备1107个 mL1的孢子悬浮液进行灌根接种,灌根前刺伤芍药根部,以灌无菌水作为对照。接种20 d后进行调查,并取样带回室内进行再分离8。1.2.2芍药根腐病病原菌
13、鉴定形态鉴定:将确定了对芍药根部有致病性的单孢纯系菌落接种于PCA(马铃薯20 g、胡萝卜20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL)培养基,置于25 黑暗培养5 d后测定菌落直径并计算生长速度;10 d后观察培养性状及色泽,并挑取少量菌丝制成临时玻片在显微镜下观测孢子、产孢细胞和分生孢子形态,同时进行显微拍照9。形态鉴定主要依据Leisle分类系统并参照Booth和Burgess分类系统10。分子鉴定:根据致病性测定和形态鉴定结果,选择代表性的菌株委托上海生工生物工程有限公司进行测序。扩增引物分别为ITS1(5-TCCGTAG-GTGAACCTGCGG-3)和 ITS4(5-TCCTCC
14、GCTTATT-GATATGC-3),将测序获得的序列在 NCBI上通过BLAST比对后,根据同源性对分离菌株与数据库中登录的近缘镰孢菌采用邻接法11构建系统发育树。1.2.3芍药根腐病病原菌室内药剂筛选采用含毒介质法12进行室内药剂筛选试验,具体方法如下。分别量取50 mL PDA培养基,装入250 mL的三角瓶中进行高压灭菌,灭菌后冷却至 50 左右,分别量取5 mL 3%苯醚甲环唑悬浮剂、30%丙硫菌唑可分散性悬浮剂、24%噻呋酰胺悬浮剂、50%多菌灵可湿性粉剂、43%戊唑醇悬浮剂、20%氟唑菌酰羟胺悬浮种衣剂、43%氟菌肟菌脂悬浮剂、25 g L1咯菌腈悬浮种衣剂、30%肟菌戊唑醇悬浮
15、剂和10%叶菌唑悬浮剂加入装有PDA培养基的三角瓶,摇匀后倒入90 mm的培养皿中;用消过毒的打孔器打取直径为6 mm的病原菌菌片,将其移入冷却后的PDA平板中央,以加水作空白对照。每种药剂分别设置5个剂量处理(表1),每个处理重复4次。在25 恒温箱中培养5 d,然后测量菌落直径(mm),计算菌丝生长相对抑制率(%);以药剂浓度对数为横坐标(x),相对抑制率的145中 国 农 业 科 技 导 报25 卷机率值为纵坐标(y),用Microsoft Excel软件绘制标准曲线,计算毒力回归方程、相关系数和抑制中浓度(EC50),比较不同药剂的毒力。抑菌率=(对照菌落直径-药剂处理菌落直径)/(对
16、照组菌落直径-菌饼直径)100%(1)1.3数据分析采用 Excel 2010 进行数据整理和分析,采用MEGA 5 的邻接法(neighbor joining)构建系统发育树。2结果与分析2.1芍药根腐病发病症状芍药发生根腐病后,根系腐烂,地上叶片出现褪绿或死亡,植株矮小。在根茎及其以下部位发病,老根发病较重,部分细根、新根也有感病。发病初期,根部产生不规则黑色或褐色病斑;然后病斑逐渐扩展并凹陷,至大部分根变黑腐烂,严重的根部全部腐烂、地上部分干枯全株死亡(图1)。2.2病原菌的形态特征自芍药根部分离的病原物生长速率较快,在PDA 培养基上 28 培养 5 d 后,菌落直径为6.6 cm。菌
17、落正面呈白色絮状,菌丝放射状生长,绒状;菌落背面中心呈紫色,边缘呈白色(图2)。在PDA培养基上培养,小型分生孢子数量较多,呈卵圆形或肾形,01个隔膜,假头状着生在产孢细胞上,大小为(2.373.14)m(6.519.28)m;大型分生孢子数量较少,呈镰刀状,较均匀,35 个隔膜,孢子大小为(3.994.74)m(22.6045.94)m(图 3A 和 B);产孢细胞单瓶梗,较短(图3C);厚垣孢子球形,表面光滑,单个或多个着生于菌丝间(图3D)。表110种药剂的施用剂量处理Table 1Dosage treatments of 10 Insecticides药剂Insecticide30%丙
18、硫菌唑30%prothioconazole20%氟唑菌酰胺20%fluxazole amide43%戊唑醇43%pentazolol43%氟菌 肟菌脂43%fluorobacterium oxime lipids50%多菌灵50%carbendazim剂量Dosage/(mg L1)0.500.250.050.030.0150.0025.005.002.500.5050.0025.005.002.500.5050.0025.005.002.501.2520.004.002.000.400.20药剂Insecticide25 g L1咯菌腈25 g L1 fluoxonitrile30%肟菌 戊
19、唑醇30%oxime bacteria amylazol3%苯醚甲环唑3%phenyloconazole10%叶菌唑10%phyllobacterazole24%噻呋酰胺24%tiafuramide剂量Dosage/(mg L1)500.00250.0050.0010.005.00250.0050.0025.005.002.505000.002500.00500.00250.0050.0025.005.002.500.500.25250.0050.0010.005.002.5014610 期杨克泽等:河西冷凉地区芍药根腐病病原鉴定及室内药剂筛选2.3致病性测定结果用分离到的高频率菌株 SY20
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