果胶和透明质酸层层修饰的β一乳球蛋白包载大黄酸纳米粒的制备及其表征.pdf
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1、炮制制剂28PharmacyandClinicsChinese Materia Medica2023;14(4)中药与临床果胶和透明质酸层层修饰的一乳球蛋白包载大黄酸纳米粒的制备及其表征聂文彪,高飞,林大胜1.2*摘要 目的:制备可口服靶向递送的多糖-蛋白质复合大黄酸纳米粒(P-HA/PEI-RHNPs),改善溶解度,提高生物利用度。方法:以-乳球蛋白(BLG)为纳米载体,负载大黄酸(RH),然后通过静电吸附作用将透明质酸(HA)和果胶(P)逐步包覆于BLG表面,制备P-HA/PEI-RHNPs,并对其进行理化性质表征。结果:激光粒度分析仪,透射电镜和高效液相色谱分析结果表明,P-HA/PEI
2、-RHNPs粒径分布均匀,具有良好的分散性和载药性能;X射线衍射图谱和傅里叶红外光谱表明RH有效包裹在载体内部,P-HA/PEI-RHNPs被成功制备;激光共聚焦显微镜可视化图像表明,HA/PEI-RHNPs具备一定的巨噬细胞靶向性。结论:P-HA/PEI-RHNPs是一种优良的纳米载药粒子,可有效改善RH溶解度和生物利用度,为RH的临床应用提供一定的理论依据。关键词 果胶;透明质酸;-乳球蛋白;大黄酸中图分类号 R282.1文献标识码 A文章编号 16 7 4-9 2 6 X(2023)04-005-06Preparation and characterization of-lactoglo
3、bulin loaded rhein nanoparticles with layer modification of pectin andhyaluronic acid/NIE Wen-biao,GAO Fei,LIN Da-sheng,/(1.School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional ChineseMedicine,Chengdu 611137,Sichuan;2.Chengdu Taihe Health Technology Group Inc.,Ltd.,Chengdu 611731,Sichuan)Abstract)Ob
4、jective:To prepare orally targeted polysaccharide-protein complex rhein nanoparticles(P-HA/PEI-RH NPs)to improve solubility and enhance bioavailability of rhein.Method:P-HA/PEI-RH NPs was prepared by using-lactoglobulin(BLG)as nanocarrier,loaded with rhein(RH),and coated with hyaluronic acid(HA)and
5、pectin(P)on the surface of BLG byelectrostatic adsorption.The physicochemical properties of the nanoparticles were characterized.Result:Laser particle sizeanalyzer,transmission electron microscopy,and high-performance liquid chromatography analysis showed that P-HA/PEI-RHNPs had a uniform particle s
6、ize distribution,good dispersibility,and drug-loading performance.X-ray diffraction patterns andFourier-transform infrared spectroscopy indicated that RH was effectively encapsulated within the carrier,and P-HA/PEI-RHNPs were successfully prepared.Laser confocal microscopy visualization images demon
7、strated that HA/PEI-RH NPs possessedcertain macrophage-targeting properties.Conclusion:P-HA/PEI-RH NPs are excellent nanocarriers for drug delivery,effectivelyimproving the solubility and bioavailability of RH,providing a theoretical basis for the clinical application of RH.Key words Pectin;hyaluron
8、ic acid;-lactoglobulin;rhein大黄酸(Rhein,R H),又名大黄苷,是一种主要从蓼科植物药用大黄、掌叶大黄和唐古特大黄根茎部位提取的天然小分子蒽醌类活性物质,其为黄色针状结晶,几乎不溶于水,溶于碱和吡啶,略溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚。现代药理学研究表明,大黄酸在抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗纤维基金项目 成都中医药大学“杏林学者”项目(QJRC2022026)作者单位 1.成都中医药大学药学院,四川成都6 11137;2.成都泰合健康科技集团股份有限公司,四川成都611731作者简介 聂文彪,在读硕士研究生,研究方向为中药新制剂、新剂型、新技术Tel:189709
9、40367Email:通讯作者 林大胜,高级工程师,研究方向为中药新制剂、新剂型、新技术Tel:13608016081Email:收稿日期 2 0 2 3-0 2-0 8化、抗菌、降糖调脂、保肝等多方面具有广泛的药理活性,特别是在炎症及其协同抗肿瘤方面有突出的治疗作用1-3。然而,由于大黄酸水溶性低,生物利用度差,极大地限制了它的开发和临床应用。因此,如何有效提高大黄酸的溶解度和生物利用度是大黄酸制剂研发的关键4.5。近年来,纳米递药系统愈发受到关注。蛋白基纳米递药系统在提升天然活性物质的溶解性、稳定性和生物利用度等方面具有巨大的潜力。蛋白作为食品原材料,营养价值高、生物亲和性好,能够被人体完
10、全消化吸收,尤其适合口服药物或功能性成分的载体。以蛋白制备的纳米载体通常具有无毒、可降解性、生物相容性高等优点6-8 。然而,单纯的蛋白基纳米递药系统易受到胃肠道环境(pH和酶)的影响,难以实现胃肠稳定性和特异性靶向释药,1.5.3果胶包被的透明质酸修饰的黄酸纳米粒的制29:Pharmacy and(ChineseMateriaMedica2023;14(4)中药与临床导致药物生物利用度低9.10)。基于本课题组的前期研究,经透明质酸、硫酸软骨素、甘露糖及果胶等修饰的蛋白基纳米递药系统可克服以上难题,有效提高了包载药物的溶出度和靶向富集释放,药物生物利用度得到明显提升1-13。基于以上背景,本
11、研究以BLG作为基材,首先将大黄酸包裹在其中,然后再将透明质酸和果胶通过静电相互作用力逐步修饰在表面,制备成多糖-蛋白质复合大黄酸纳米粒子(P-HA/PEI-RHNPs),以期改善天然活性成分RH溶解度低,生物利用度差等问题,最后,对所制备纳米粒子进行理化性质表征,为大黄酸纳米粒运用于临床治疗提供一定的理论依据。1材料与方法1.1仪器Litesizer500激光粒度分析仪,安东帕(上海)商贸有限公司;Agilent1260型高效液相色谱仪,美国Agilent公司;ESJ205-S电子分析天平,沈阳龙腾电子有限公司;YM-150Y超声波细胞粉碎机,上海豫明仪器有限公司;HMS-901D6联多点加
12、热磁力搅拌器,深圳市博大精科生物科技有限公司;JEM2100F透射电子显微镜,日本电子株式会社;D8X射线衍射仪,德国Bruker公司;TSCSP8激光共聚焦显微镜,德国Leica公司;IRTracer-100傅里叶变换红外光谱仪,岛津企业管理(中国)有限公司。1.2药品与试剂大黄酸(RH,批号wkq22052602,纯度98%),四川维克奇生物科技有限公司;-乳球蛋白(BLG,批号C220816),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;聚乙烯亚胺(PEI,批号E220613,Mr25000),上海西格玛奥德里奇贸易有限公司;透明质酸(HA,批号XC220512Mr8000),华熙生物科技股份有限公
13、司;果胶(P,批号C211226,酯化率7 4%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DAPI染色液,上海艾博抗贸易有限公司;香豆素6(C6),上海谱振生物科技有限公司;激光共聚焦小皿,北京硕华佰奥生物科技有限公司;二甲基亚砜(DMSO),北京汇海科仪科技有限公司;DMEM培养液、青-链霉素溶液,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;胎牛血清,浙江天杭生物科技股份有限公司;甲醇、磷酸,均为色谱纯,成都市诺尔施科技有限责任公司。1.3细胞小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RaW 264.7)购自上海盖恩生物科技有限公司,培养在含有10%热灭活胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM完全培养基中,所有细胞均放置于37
14、 C,5%C O 2 的细胞培养箱中培养。1.4大黄酸测定色谱条件色谱柱:Ascentis?Express C18柱(2 50 mm*4.6mm,5m);流动相:甲醇-0.1%磷酸水(8 5:15);流速:1.0 mLmin;柱温:30 C;进样量:10 l,检测波长:2 54nm。1.5纳米粒的制备1.5.1大黄酸纳米粒的制备正如之前研究报道,透析法是一种成熟的制备纳米粒的方法,因此在本研究中用于制备-乳球蛋白包载大黄酸纳米粒(RHNPs)1.14.1。简单地说,将50 mg的BLG溶解在2 0mL的去离子水中,匀速搅拌得到BLG溶液;与此同时,将2 mgRH溶解在1mLDMSO中,然后在搅
15、拌时缓慢滴人BLG溶液中。之后,在冰浴条件下,用超声波细胞粉碎机以7 0%的振幅超声5min,形成水包油乳液。反应1h后,将乳液移至透析袋(Mr1000Da)中,用去离子水透析8 h以除去残留的DMSO和小分子杂质。最后,用0.45m微孔滤膜过滤即获得RHNPs1.5.2透明质酸修饰的大黄酸纳米粒的制备按照1.5.1方法制备RHNPs后,用去离子水配置浓度为5mgmL的PEI溶液,将PEI溶液以2 0 l/ml逐滴加人到RHNPs溶液中,搅拌40 min后,过滤得到PEI-RHNPs溶液,然后再将1ml质量分数为0.1%的HA溶液缓慢滴人PEI-RHNPs溶液中,在2 5C下反应1h,使HA静
16、电粘附在PEI-RHNPs表面,过0.45m微孔滤膜即得HA/PEI-RHNPsl16.17备按照1.5.2 方法制备得到HA/PEI-RHNPs后,用去离子水配置浓度为1mgmL的P溶液,并将其滴入HA/PEI-RHNPs溶液中,室温下反应1h,带负电荷的P溶液通过静电吸附自动涂覆在HA修饰的大黄酸纳米粒子的阳离子表面,最终形成P-HA/PEI-RHNPs,采用0.45m微孔滤膜过滤,4保存,以便后续实验使用18 1.6层层修饰的大黄酸纳米粒P-HA/PEI-RHNPs的基础表征1.6.1粒径、多分散指数(PDI)和Zeta电位分别吸取待测样品2 mL,利用Litesizer500激光粒度分
17、析仪分别测定所制备纳米粒子的平均水动力直径、PDI和Zeta电位值。每个样品均重复测量三次。30PharmacyandChineseMateriaMedica2023;14(4)中药与临床1.6.2P-HA/PEI-RHNPs的微观形貌包为了更为直观的了解所制备纳米制剂的微观形态特征,利用透射电子显微镜进行观察。取适量的样品P-HA/PEI-RHNPs溶液放置于离心管内,加人适量的超纯水稀释,在超声波清洗仪中超声进行分散,约510 min,使样品溶液分散均匀。用弯头镊子将铜网从样品盒中取出,放置于制样板上,再用1ml医用灭菌注射器吸取少量样品溶液滴加于碳支持膜上,停留5min,用滤纸吸去多余液
18、体,然后再用2%的磷钨酸溶液负染2min,自然晾干后,在透射电子显微镜下观察P-HA/PEI-RHNPs的微观形貌。1.6.3包封率(EE%)和载药量(LE%)的测定1.6.3.1RH标准曲线的绘制精确称取2 mgRH,加人适量甲醇溶解,然后在50ml容量瓶中定容,低温避光充分溶解后,稀释成25.00 gmLl、16.6 7 gmLl、12.50 g*mLl、8.33gmLl、6.2 5 g:mLl、4.17 gmL 和3.13 gmLl的RH溶液。以RH的特征吸收波长2 54nm为激发波长,用高效液相色谱仪分别测定在此波长下不同浓度RH溶液的峰面积。以峰面积为纵坐标,RH浓度为横坐标绘制标准
19、曲线。1.6.3.2P-HA/PEI-RHNPs包封率和载药量的测定采用高效液相色谱法测定所制备纳米的包封率与载药量。将制备好的P-HA/PEI-RHNPs溶液加入适量甲醇,通过涡旋、超声等处理破坏纳米体系,药物溶解后,过0.2 2 m微孔滤膜,通过高效液相色谱法测定包封率与载药量。计算公式如下:EE%=(W2-W1)/W2100%LE%=(W2-W1)/W3100%式中,W1为游离药物含量,W2为投药总量,W3为载体和药物总投量19 。1.6.4X射线衍射图谱按照P-HA/PEI-RHNPs的制备流程,在药物RH不参与的条件下,制备空白纳米溶液(blankNPs)。将制备好的P-HA/PEI
20、-RHNPs溶液和blankNPs溶液分别放置于真空冷冻干燥机中,获取冻干粉末。将RH粉末、所有材料混合物粉末,blankNPs粉末和P-HA/PEI-RHNPs粉末少许放在清洁的样品台上,用载玻片压平,分别放入X射线衍射仪中,测定各自的光谱。X射线衍射仪采用铜靶,K射线,管电压为40 kV,管电流为30 mA,扫描范围从5到9 0,速度为5minl。1.6.5傅里叶变换红外光谱取少量冻干过的P-HA/PEI-RHNPs粉末在玛瑙中充分磨细,再加人干燥的KBr粉末(P-HA/PEI-RHNPs粉末:KBr=1:10 0),继续磨研几分钟,直到完全混合均匀,并将混合物在红外灯下烘干,约取10 小
21、勺混合物于压膜内,在压片机(调至6 0 MPa)上压2 min,然后泄压取出,即可得一薄透明薄片,把此薄片装于薄片夹持器上,然后在傅立叶变换红外光谱仪上进行测定分析。同样地,RH粉末、所有材料混合物粉末和blankNPs粉末重复以上操作进行分析。1.6.6P-HA/PEI-RHNPs的靶向摄取研究为了研究HA功能化的P-HA/PEI-RHNPs的细胞靶向摄取特性,将RaW264.7细胞作为其HA受体高表达的细胞模型。由于RH没有明显的荧光,因此利用荧光探针香豆素6(C6)代替RH制备NPs,通过激光共聚焦显微镜对RaW264.7细胞靶向摄取进行可视化图像分析。此外,基于P-HA/PEI-RHN
22、Ps口服纳米递药系统的设计,最外层包被的P主要作为胃肠保护材料,可在肠道微生物的作用下降解,进而暴露出对Raw264.7巨噬细胞表面受体高表达的HA/PEI-RHNPs。因此,在没有微生物菌群的参与下,仅在HA/PEI-C6NPs、P EI-C 6 NP s 和FreeC6中进行靶向摄取分析,而在P-HA/PEI-C6 NPs中不进行分析12 。具体操作流程如下:首先,将处于生长对数期的巨噬细胞接种在激光共聚焦小皿中,密度为110 个/皿,然后将小皿置于37 C培养箱中,于5%CO,下孵育过夜;待贴壁后,弃掉原培养基,再分别向其中加入含HA/PEI-C6NPs、P EI-C 6 NP s 和F
23、reeC6的新鲜培养基(以C6计,浓度为10 0 ngmL)并继续放置于培养箱中孵育;4h后,再次弃掉皿中的培养基,并用冷的PBS小心缓和冲洗3遍,然后用4%多聚甲醛溶液固定10min,再用冷的PBS清洗3遍,加人1mLDAPI溶液,10min后再次吸取冷PBS进行清洗;最后,加入抗荧光猝灭剂,将小皿放置于激光共聚焦显微镜下进行观察。2结果2.1P-HA/PEI-RHNPs的粒径,PDI及Zeta电位按照上述制备方法,最终所得P-HA/PEI-RHNPs溶液呈澄清黄色状,且无沉淀析出。应用激光粒度分析仪测定了每一步制备形成的NPs的粒径,PDI及Zeta电位,结果如表1所示。RHNPs的平均水
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