DB21∕T 3253—2020 小反刍兽疫病毒实时荧光RT-PCR检测方法(辽宁省).pdf
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1、DB21宁省地方标准DB21/T3253一2020反当兽疫病毒实时荧光RT一PCR检测方法.220小ICsB41辽De v e l o p m e n tt h em e t h o do fr e a l一t i m ef l u o r e s c e n tRT一PCRf o rd e t e c t i o no fPPRV2020一04一30发布2020一05一30实施辽宁省市 场监督 管理局发布DB21/T3253一2020目、,生幽目叮舀.1范围.”2规范性引用文件.3缩略语.4原理.5仪器和器材.6试剂和引物.7操作步骤.8试验成立条件与结果判定9检测过程中防治交叉污染的措施1
2、0废弃物处理.IIDB21/T3253一2020士一口一Rl J本标准按照GB/ T1.1一2009给出的规则起草。本标准由动物卫生标准化技术委员会(辽宁)提出。本标准由辽宁省农业农村厅归口。本标准起草单位:辽宁省农业发展服务中心、洛阳莱普生信息科技有限公司、辽宁佰瑞生物科技有限公司。本标准主要起草人:邓文超、石霖、魏园 园、吴继阳、张皓淳、王冰、张鑫、王竹、刘金玲、董娜、高原、杨作丰、彭潇潇、姚伟、里里、陈腾、胡影。本标准发布实施后,任何单位和个人如有问题和意见建议,均可以通过来电和来函等方式进行反馈,我们将及时答复并认真处理,根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址:辽宁省农业
3、农村厅(沈阳市和平区太原北街2号),联系电话:024一23447862;标准起草单位通讯地址:辽宁省动物及产品检疫中心(沈阳市沈河区万柳塘路105号甲),联系电话:024一24229579。DB21/T3253一2020小反自兽疫病毒实时荧光R丁一p CR检测方法范围本标准规定了小反色兽疫病毒实时荧光RT一PCR检测方法的技术要求。本标准适用于在生物安全IT级(BSL一2)以上的实验室进行小反当兽疫病毒病的诊断、监测及流行病学调查,适用于反色动物血液血清、淋巴结及口鼻棉拭子中小反当兽疫病毒核酸的RT一PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注
4、日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T19495.2一2004转基因产品检测实验室技术要求中华人民共和国农业部公告第302号(兽医实验室生物安全技术管理规范)农业部关于印发病死及病害动物无害化处理技术规范的通知(农医发201725号)3缩略语下列缩略语适用于本标准。PPRV:小反色兽疫病毒(PeSt ed e sPe t i t SRu m i n a n t Sv i r u s)RNA:核糖核酸(ri b o n u c1e1ca c i d)RNaSe:核糖核酸酶(ri b o n u C1e a s e)DEPC:焦炭酸二了
5、酉旨(d1e t h y l p y r o Ca r b o n a t e)b p:碱基对(卜。、,p a i r)RT一PCR:反转录聚合酶链成反应(r e v e r s et r a n SCr i Pt i o np o l y m e r a s eCh a i nr e a Ct i o n)d NTP:脱氧核糖核营三磷酸(,二:!、x,一r1b o n u C1e o s i d et r i p h o s p h a t e)PBS:磷酸盐缓冲液(p h oSp h d t0b u厂,二So l u ti o n)TAE:三轻甲基氨基甲烷一乙酸电泳缓加;反(T一15a C
6、et a t e-EDTAb u f f e r)4原理本方法针对小反当兽疫病毒高度保守区域设计特异性引物刁训又针六反应体系中含小反当兽疫病毒基因组模板的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCP过枉中相应通道的信号强度进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。5仪器和器材5.2台式冷冻离心机(离心范围O一20000r/m i n)冰箱:4士1,一20士1,一80士1DB21/T3253一20205.3全自动荧光定量PCR仪(ABI700O、ABI7300、ABI7500、ABI7900、BIO一Ra dCFX384To u c h、BIO一Ra dCFX96To u c h
7、等)5.4离心管:15m L、1.5m L和0.2m L。5.5微量可调移液器:100一1000p L,20一200p L,10一100p L,5一50p L,2一20p L,0.5一10p L,0.2一2p L。6试剂和引物6.1RNA抽提试剂:Tr i Zo l外观为淡粉色,于4一SOC保存。6.2氯仿:一20预冷。6.3异丙醇:一20预冷。6.4DEPC水:去离子水中加入0.1 %DEPC,37作用1h或室温过夜,121士1C高压灭菌15m i n。6.575乙醇:用无水乙醇和DEPC水配制,一20预冷。6.6阳性对照:PPRV细胞培养物。6.7阴性对照:灭菌水。68Pr i m eSc
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