SN∕T 2757-2022 植物线虫检测规范.pdf
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1、ICS 65 .0 20 .20CCS B 16SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 275 720 22 代替 SN/T 275 720 11植物线虫检测规范Rules for detection of plant parasitic nematodes20 22-0 7-0 7 发布20 23-0 2-0 1 实施中华人民共和国海关总署 发布SN/T 275 720 22.t /. 刖 百本文件按照GB/T 1. 120 20标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件代替SN/T 275 72011植物线虫检测规范,与SN/T 275 720 1
2、1相比.除结构调整和编 辑性改动外.主要技术变化如下:- 增加了术语和定义、现场取样章节;一对第7章进行了丰富.增加了各环节的要点和注意事项;- 删除了原文件附录A中的线虫分离方法、附录C中的常用培养方法和附录D中的线虫常用溶 液;- 在附录A中增补了 De man公式、线虫学描述常用语和通用线虫分子鉴定方法。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位:中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国宁波海关、中华人民共和国天津海 关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国昆明海关、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国青 岛海关、中华人民共和国黄埔海关。本文件主要起草人:边勇、顾建锋、
3、王金成、赵立荣、杜宇、刘若思、刘乐乐、皋司虎、封立平、曹志玲。本文件于2011年发布为SN/T 275 7201 1.本次为第一次修订。ISN/T 275 720 22植物线虫检测规范1范围本文件规定了进出境植物线虫的检测规范。本文件适用于进出境植物及植物产品、媒介昆虫、土壤及栽培介质中线虫的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中.注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27402实验室质量控制规范植物检疫
4、SN/T 1848植物有害生物鉴定规范SN/T 2122进出境植物及植物产品检疫抽样SN/T 1724进境针叶树原木、木制品和木质包装材料中松材线虫的检疫操作规程SN/T 4643线虫标本采集分离保存规范 3 术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1De Man 公式 De Mans formulaDe Man (1880 )提出的一套用系列字母代表的线虫形态测量值或测量比值.适用于线虫形态的 描述。3.2植物线虫 plant nematode能够侵染植物引起植物病害造成产量损失或植物产品质量变劣的线虫类群。注:通常被称为植物寄生线虫或植物病原线虫,简称植物线虫。3. 3媒介昆虫 vec
5、tor insect所有能够携带、传播植物病原线虫的昆虫。注:常见的线虫媒介昆虫有吉丁虫科Buprestidae,象甲科Curculionidae,小港科Scolytidae和天牛科 Cerambycidae 等 s4 原理植物线虫可随植物及植物产品、媒介昆虫、土壤及栽培介质等作远距离传播。线虫检测工作的一般 原理是利用线虫的自主活动性、趋水性、密度、体型大小等特点使用直接解剖法、改良漏斗法、密度离心 1S7T 275 720 22法、漂浮法等将其从寄主植物、土壤或栽培介质、包装材料等中分离出来.然后以形态学方法为主.辅以 De Man测计值.结合分子生物学、生态学、生物学、生物化学、细胞学等
6、方法.综合判定其分类地位一 科、属、种及亚分类单元的一项工作。5仪器设备、器具和主要试剂5 . 1仪器设备体视显微镜(具透射光源和落射光源)、生物显微镜、冷藏冰箱、超低温冰箱、离心机、PCR仪、电泳 仪、凝胶成像系统、高压灭菌锅、烘箱、加热板、水浴锅、离心机等。5 .2 器具自封袋、表面皿或培养皿、载玻片、盖玻片、凹玻片、网筛(10目、20目、50目、80目、120目、360目、 500目)、烧杯、漏斗、漏斗架、浅盘、乳胶管或硅胶管、止水夹、小银子、斧头、剪刀、医用解剖刀、线虫滤纸 或面巾纸、酒精灯、干燥器、试管、线虫挑针、记号笔、毛刷、毛笔、玻璃纤维丝、PCR管、可调式微量移液 器(2 mL
7、-1 000例,)及相应的吸头等。5 .3 主要试剂实验用试剂一般应为分析纯实验用水应符合GB/T 6682相关规定。主要试剂包括:福尔马林 (4%甲醛)、指甲油、阿拉伯树胶、凡士林、纯甘油、无水乙醇、石蜡、蔗糖、核酸胶染料(GelRed)、PCR反 应所需引物、2XTag MasterMix 预混液、蛋白酱 K(20 mg/mL)、Taq D、A 聚合能、DL2 000 Marker, 冰乙酸(GHJ)2)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠(NazEDTA 2H。)、无RNase无菌 水和灭菌双蒸水等。6 现场检疫与取样6. 1现场检疫按照SN/T2122的方法进行现场检疫和抽
8、样。重点检查是否有线虫危害症状.应注意线虫为害早 期通常无明显症状.侵染后期症状逐步出现.具体症状与植物种类、可能携带线虫种类、侵害程度、为害 部位等有关.除6. 2所述常见症状外.还可针对不同种类,参考相关文献资料予以掌握。6.2 症状检查6.2 . 1植物的检查地上部分有无生长不良植株矮化、叶色失绿、黄化、坏死、萎焉.叶、茎或其他组织是否坏死、肿大、 畸形等:植物材料横切面有无腐烂、变色。茎、叶、花、芽、果实等线虫可能寄生的部位均应仔细检查.看 是否有线虫为害症状。地下部分有无根系腐烂变黑.须根是否增生.根部有无斑点、斑痕等。根部特别要注意根茎、块茎、 球茎等部位有无根结、痹瘤有无黄色、褐
9、色或白色针头大小的颗粒状物茎杆中部是否有孔形、环形、点 状腐烂.块根、块茎是否干缩龟裂和腐烂等。6. 2. 2 种子的检查肉眼和手持放大镜仔细检查种子拣出畸形、变色、虫痹、干枇种子等有为害症状的可疑种子并收 集其中夹带的介质或土壤等杂质.分别用塑料袋装好.加贴标识.带回实验室检测。2SN/T 275 720 226.2.3其他材料的检查植物、植物材料和植物产品等是否夹带土壤或其他栽培介质等;木质部是否有蓝变.有无媒介昆虫 栖居的痕迹如侵入孔、蛀道、蛹室等:纵切植株组织是否有虫蛀隧道及媒介昆虫幼虫与成虫等。如有 收集相关样品,带回实验室检测。6.3取样检查时发现明显症状的情况下.应有针对性地抽取
10、具有可疑症状的样品及邻近样品;对于无可疑症 状的样品则按要求随机抽样;对于根部包裹有栽培介质的植物.应以主根为中心进行取样。采集的样品 分别用塑料袋装好.加贴标识.并尽快送实验室检测。7 实验室检测7. 1样品接收样品传递过程中应避免在高温环境下时间过久。实验室收到样品后.如不能立即对样品实施检测, 应将样品置于4 (10 冷藏冰箱进行短期保存.注意保湿、透气、避光.并尽快实施检测。7.2 样品的前处理7.2 . 1植物组织将植物材料(根、茎、叶、果实及种子)切成小段或薄片(厚度0 .5 cm).或将种子等较小的植物材 料撕开待测。在进行植物组织样品前处理过程中可同时对切开的植物组织进行症状检
11、查.察看是否 存在线虫侵害状.如组织穿孔、腐烂等。7. 2. 2 土壤及栽培介质将从植物材料和运输工具上收集到的土壤或介质混匀.取100 mL以上作为待测样品。不足100 ml. 则全部检测。7.2.3媒介昆虫将媒介昆虫或部分虫体放入小钵里研碎,加水浸泡数小时后直接镜检。7. 2. 4 原木、木制品和木质包装材料将原木、木制品和木质包装材料劈成薄片(厚度0 .5 cm)作为待测样品。具体可参照SN/T 1724。7. 3线虫分离线虫分离是线虫检测的关键步骤之一,首先应考虑如何更有效地获得目标线虫.根据线虫的寄生 部位、体型大小等因素不同.在进行线虫分离时.应选择一种或多种方法进行线虫分离。如改
12、良漏斗法 仅适用于分离蠕虫形线虫.而线虫抱囊的分离则应使用直接解剖法、过筛法或漂浮法。在具体操作时.也需根据重点对象.对分离条件进行适当调整.如分离一些体型较大的蠕形线虫时. 采用漏斗法时在确保分离液不会被土壤、植物颗粒等沉淀物严重污浊前提下.应使用孔径较大的筛网、 面巾纸或纱布等作为载体.同时适当增加分离时间(如从24 h增加到48 h.但应注意过长的分离时间有 可能导致线虫死亡以及其他微生物大量滋生等影响观察效果.因此一般分离时间不超过72 h),也可采 用密度离心法等适宜方法。3S7T 275 720 22在针对特定种类进行检测时.还可根据该类线虫的主要寄生部位.对样品不同部位分别进行线
13、虫分 离.如检测一些叶芽寄生线虫时.将植物叶芽与植物根茎分别进行分离检测,可减少混合分离时根部腐 生线虫对鉴定工作的干扰提高工作效率。常用的线虫分离方法可参见SN/T 4643。7.4 体视显微镜观察分离获得的线虫悬浮液中通常包含多种线虫.其中尤以腐生线虫为多。为提高工作效率.一般应首 先使用体视显微镜在适当倍数下进行线虫初筛。具备一定经验的检测人员可通过体视显微镜对植 物线虫和腐生线虫等进行准确区分.或对植物线虫的检疫意义进行初步判断.发现具有检疫意义的植物 线虫时.再挑取线虫制成临时玻片或永久玻片后.再使用生物显微镜进行形态观察或鉴定。7.5 线虫标本制作线虫标本制作方法参见附录7.6 生
14、物显微镜观察和测量在生物显微镜下观察线虫的形态结构.进行特征观察.使用线虫分类检索表或相关线虫鉴定资料进 行特征比对,对主要鉴定特征进行重点观察、拍摄和测计.进而进行形态学判定。对线虫进行测计通常 采用De Man公式,同一性别、同一龄期的线虫个体需测量20条以上.不足20条的应全部测量.7.7 二次取样或线虫培养当发现疑似检疫性线虫种类.且分离到的线虫数量较少或为幼虫时.可根据实际情况.进行二次取 样再分离。对于有培养方法的种类.可进行培养或孵育后再进行形态鉴定。注:多数情况下线虫培养时间较长,对环境条件等有较高要求,且易被蜻虫、雪菌等污染,导致培养失败,宜同时采 取分子生物学等方法进行鉴定
15、。8线虫的形态学鉴定8. 1工作要点线虫的形态学鉴定主要是通过对虫体的外部特征(如体形、体表、头部和尾部特征)、内部特征(如消 化系统、生殖系统等)的观测而判断其分类地位的过程通常雌虫具有更丰富的鉴定特征是进行种类判 断的主要依据.而一些种类也会利用雄虫和幼虫的一些特征作为依据在进行植物线虫检测鉴定时应 优先进行形态学鉴定.至少将线虫鉴定到属的水平才能对其是否具有潜在检疫意义作出初步判断。形态学鉴定的前提是熟知线虫形态学术语掌握各术语所指特征的具体位置受标本制作效果、线 虫发育程度、观察体位、观测焦距等诸多因素影响.一些特征在观察时难以准确观测.甚至无法看到.需 要针对多个个体进行观察反复比较
16、.并进行综合判断。除观察结构特征外.对线虫体长、体宽、虫体各个体段的长度、比例以及一些特征结构的长宽等体型 特征的测计.也是线虫鉴定的参考依据。对线虫进行测计时,应首先掌握各值测量的方式.如虫体全长 应从口孔到尾端计算(虫体弯曲时应沿虫体中线测量曲线);体宽指体中部宽度(最大体宽一般则在雌虫 的阴门或雄虫的输精管附近);尾长是从肛门的体中部测量到尾最末端等,8.2 线虫属的鉴定线虫属一级的鉴定一般依靠形态学方法即可完成。鉴定工作中.使用某一分类系统.通过二项检索 确定所在属后.再对其属内特征进行观察确认主要特征符合描述时即可判定通常观察利用到的特征 4SN/T 275 720 22包括。- 体
17、型:长短、形状、最大体宽、雌虫是否膨大、雌雄异型等,- 角质膜:厚度、体表环纹的结构及宽度、侧带和侧线数量、侧尾腺口位置等。一头部:突出程度、形状、环纹数:有无头冒、有无乳突或刚毛;头部骨架发育程度;侧器位置及形 状等。- 口腔:形状及大小、唇片的形状、唇环数量等。- 针:形状、长短、内空针或齿针.基部球形状、口针基杆长度、口针锥部长度等。- 食道:背食道腺开口的位置:食道体部的形状、长度和厚度;中食道球的形状、大小和内部瓣门 的有无;峡部长度和形状;后食道部的形状、大小及与肠连接部位的覆盖情况等- 雌虫:阴门的位置和形状;阴道的长度和壁厚:生殖管的数目及位置、回折或伸展:后阴子宫囊 的形状、
18、长短;卵巢的长度及其细胞的排列;输卵管结构;受精囊形状和大小;子宫的形状和大 小;卵的形状和大小等。- 雄虫:生殖管的数目及位置、回折或伸展:精巢及其细胞的排列情况;输精管的长度和形状:精 子的数目、形状和大小;交合剌的形状和大小、引带的形状和大小;交合伞的有无和延展程 度等。- 尾部:形状、长度:侧尾腺口的位置和大小、生殖乳突的位置和数目;尾尖突的有无和形状等 注:目前,在植物线虫分类研究方面有多个分类系统并存,各分类系统既具有许多共同点也存在差异,国内外一些 文献资料由于采用了不同的分类系统,在线虫分类描述时可能存在差异,在参考使用时需特别注意,现有出入 境检验检疫行业标准,多数使用的分类
19、系统为Maggenti(1991)系统,此外顾建锋等编著的口岸植物线虫实用 鉴定技术一书中,也介绍了 Perry &. Moens(20 13)系统.但相对而言,在属级及以下的线虫分类较为稳定,检 疫鉴定工作重点是准确辨识出对象的种类,至于其高分类阶元层次的变化并不会对鉴定造成实质影响,8.3 线虫种的鉴定种的鉴定主要依据形态鉴定结合分子生物学等其他方法进行。在确定线虫所在属后开展种的鉴 定。对于具有检疫意义的种类.通常需要鉴定到种。首先需要根据本属分类检索表缩小鉴定范围.确定 疑似的种类范围.具备条件时.也可先使用分子生物学方法确定疑似种范围。在确定疑似种范围后.进一步使用该疑似种及近似种的
20、鉴定资料(包括原始文献、近期文献、综述性 描述文献、鉴定标准等)进行反复观察比较重点观察关键性鉴别特征特别是与近似种的关键性差异特 征并进行测量和拍照。不同属线虫分种鉴定时主要利用的细微特征差别较大.很难统一概括。在进行线虫定种鉴定时一 般主要观察成熟雌虫和雄虫.重点观察测量口针长短.侧区内部结构、侧线数量.受精囊形状.阴门形状. 后阴子宫囊长短.体表附属物个数、位置.尾部形态、突起、交合刺形态等特征。对于根结线虫和抱囊线 虫还需分别制作会阴花纹和阴门椎进行观察。9其他鉴定方法一般可采用分子生物学检测方法辅助进行鉴定通用分子检测方法见附录C,也可结合生态学、生 物学、生物化学、细胞学等方法提供
21、参考信息。10结果判定及复核以形态学鉴定为主.辅以其他分类鉴定方法.判定线虫种类。对于按照相关规定应进行复核鉴定的 种类.复核时需要提供寄主样品、线虫虫样或标本、鉴定时采集的图像或其他检测数据按规定流程送往 5S7T 275 720 22有资质的实验室进行复核。11 记录按照GB/T 27402和SN/T 1848的要求.详细记录检验过程.包括抽样方法、症状描述、检测方法、 检测过程、检测结果报告、检测人员等。线虫形态特征的描述用语应规范.常用线虫形态描述用语见附 录D。12样品保存对已经检出检疫性线虫的植物、植物材料、植物产品、媒介昆虫、土壤及栽培介质.经登记后应保存 在低温条件下(5 10
22、 )、干燥、防虫、防鼠处.并标明样品编号、截获日期、截获人、寄主名称、样品 来源等.以备复验、谈判和仲裁。线虫虫体的保存.参见SN/T 464313无害化处理实验室检出的线虫、线虫浸出液、废弃物(如植物、植物材料、土壤或栽培介质等)、用具(分离器、烧 杯等)等.根据样品种类、线虫的检出情况,采用杀死活体线虫、煮沸用具、高压灭菌处理废弃物等方法进 行无害化处理.防止有害线虫传播扩散。6SN/T 275 720 22附录 A (资料性) De Man公式常用测量参数和部分常见线虫缩略语nL测计标本数;-体长;abcic-体长/最大体宽:-体长/体前端至食道与肠连接处的距离;-体长/体前端至食道腺末
23、端的距离;-体长/尾长;-尾长/肛门处体宽;V-体前端至阴门的距离/体长义10 0(体前端至阴门距离占体长 的百分数);V,VAStylet(st)TailTG1G2SPi (Spicule length)G、Gub (Gubernaculums length)M()DGOPUSMBhRRBRstRoesRexRhemRVRVanRanOst(ODS)Oph(ODP)OGRWEx-体前端至阴门的距离/体前端至肛门的距离X 100;一阴门到肛门之间的距离:-口针长度;尾长;泄殖腔开口至精巢先端的距离/体长X 100;阴门至前生殖腺先端的距离/体长X100;阴门至后生殖腺先端的距离/体长X100;
24、-交合刺长度:引带长度;- 口针针锥部长/口针长;- 口针基部至背食道腺开口的距离/口针长X 100;- 背食道腺开口至口针基球的距离;后阴子宫囊长度:- 体前端至中食道球中间的距离/食道长;- 尾透明区长;一体环数;- 体中部1个体环的宽度;- 唇盘与口针基部之间的体环数;- 唇盘与贲门瓣之间的体环数;- 唇盘与排泄孔后第一环之间的体环数;- 唇盘与半月体后第一环之间的体环数; 阴门与尾端之间的体环数; 阴门与肛门之间的体环数;- 肛门与尾端之间的体环数;- 齿尖针长;一齿托长;- 口孔到诱导环长度;-最大体宽;-excretory pore.排泄孔指位于腹面表皮处的一个排泄物开 口 通常位
25、于中食道球附近;7SN/T 275 720 22PhasGranek s ratiophasmids,侧尾腺,指位于尾部肛门附近的一对感觉器官;-格氏比值.指肛肛门到阴门膜孔边缘的最近距离/阴门膜孔 直径。8SN/T 275 720 22附录 B (资料性) 线虫标本制作方法B. 1总则在使用生物显微镜进行线虫形态观察时需要先将线虫制作成玻片标本。在初步鉴定或观察时可 制成临时玻片.需要深入观察或长期保存时.则需要制成永久玻片。两种方法各有优点。一般来说.临 时玻片下的线虫体内水分充足消化系统、生殖系统等较为充盈且可对体态进行调整有利于多角度观 察部分结构更易判断:而永久玻片经过线虫固定、脱水
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