海洋真菌Aspergillus terreus次生代谢产物研究.pdf
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1、天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1732-1738,1831海洋真菌Aspergillus terreus次生代谢产物研究李思敏,周金彩,何蓉,唐颖楠,周思倩2 3,王雅静”,龙红萍2.3*1湖南科技职业学院药学院,长沙410 0 0 4;湖南中医药大学第一附属医院,长沙410 0 0 7;3湖南中医药大学,长沙410 2 0 8摘要:采用大米固体发酵技术,研究海洋来源真菌土曲霉Aspergillus terreus的次生代谢产物,通过大孔吸附树脂柱层析、硅胶柱层析、凝胶柱层析和半制备高效液相等方法对A.terreus大米发酵产物的乙酸乙酯萃取物进行分离纯化,再利用
2、核磁共振波谱(HNMR、3CNM R)和质谱数据(HR-ESI-MS),结合与文献数据对比,共鉴定出13个化合物,分别为丁内酯I(1)、3-h y d r o x y-5-4-h y d r o x y-3-(3-me t h y l-2-b u t e n-1-y l)p h e n y l me t h y l -4-(4-h y d r o x y p h e n y l)-2(5H)-furanone(2)、()-a s p e r t e r e t a l F(3)、a s p e r i mi d e A(4)、洛伐他汀(5)、terretonin(6)、me t h y l-3
3、,4,5-t r i me t h o x y-2-(2-(n i c o t i n a mi d o)b e n z a mi d o)b e n z o a t e(7)、b i s d e t h i o b i s(me t h y l t h i o)a c e t y l a r a n o t i n(8)、a c e t y l a r a n o t i n(9)、环(L-脯-L-)二肽(10)、环(D-亮氨酸-L-脯氨酸)二肽(11)、callyspongidipeptideA(12)、(3R,4R)-6,7-d i me t h o x y-4-h y d r o x
4、y me l l e i n(13),其中化合物12 为首次从土曲霉中分离得到。通过CCK-8法评价化合物对低氧/复氧诱导的PC12细胞损伤的保护作用,结果显示化合物1、3、5、6 和7 能显著减少氧化应激产生的细胞损伤,呈现出一定的神经细胞保护活性。本研究为进一步挖掘土曲霉的活性次生代谢产物提供了基础。关键词:真菌;土曲霉;次生代谢产物;结构鉴定;神经保护中图分类号:R284.2D01:10.16333/j.1001-6880.2023.10.009Study on the secondary metabolites from marine-derived fungi Aspergillus
5、 terreusI Shool of Pharmaceutical Sciences,Hunan Vocational College of Science and Technology,Changsha 410004,China;Abstract:The secondary metabolites of the rice solid fermentation of marine-derived fungus Aspergillus terreus were studied.Thirteen compounds were isolated and purified by macroporous
6、 resins,silica gel column chromatography,and semi-preparationliquid method.Their structures were identified as butyrolactone I(1),3-hydroxy-5-4-hydroxy-3-(3-methyl-2-buten-1-yl)phenylmethyl)-4-(4-hy-droxyphenyl)-2(5H)-furanone(2),()-asperteretal F(3),asperimide A(4),lovastatin(5),terretonin(6),methy
7、l-3,4,5-trimethoxy-2-(2-(nicotinamido)benzamido)benzoate(7),bisdethiobis(methylthio)acetylara-notin(8),acetylaranotin(9),cyclo-(L-pro-L-Val)(10),cyclo(D-Leu-D-Pro)(11),c a l l y s p o n g i d i p e p t i d e A (12),(3R,4R)-6,7-dimethoxy-4-hydroxymellein(13)using NMR and HR-ESI-MS data,and by compari
8、ng the information with litera-ture data.Compound 12 was isolated from A.terreus for the first time.The protective effects of these compounds on the viabili-ty of hypoxia/reoxygenation-induced PC12 cell damage were evaluated by CCK-8 assay in vitro,the results showed that com-pounds 1,3,5,6,and 7 co
9、uld significantly reduce the cell damage caused by oxidative stress,which presented neuroprotectiveactivity in PC12 cells.This study lay a foundation for further exploitation the active secondary metabolites of A.terreus.Key words:fungi;Aspergillus terreus;secondary metabolites;structural identifica
10、tion;neuroprotective activity收稿日期:2 0 2 3-0 3-0 8基金项目:湖南省中医药管理局科研项目(B2023135);湖南中医药大学“双一流”学科建设项目(2 2 JBZ025)*通信作者 Tel:86-731-89669209;E-mail:文献标识码:ALI Si-min,ZHOU Jin-cai,HE Rong,TANG Ying-nan,ZHOU Si-qian?*,WANG Ya-jing,LONG Hong-ping2 The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Chan
11、gsha 410007,China;3 Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China接受日期:2 0 2 3-0 6-2 5文章编号:10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)10-17 32-0 8,近年来,海洋天然产物吸引了全世界的化学家和生物学家的关注,目前已从海洋生物中分离鉴定出1.6 万多种海洋天然产物,海洋微生物被认为是o.2,3*Vol.35生产新型抗生素、抗肿瘤和抗炎药物的宝贵来源 。海洋真菌特别是与海洋藻类、海绵、无脊椎动物和沉积物相关的真菌是生物活性次代谢产物的有效生成者,由于它们在温度、营养物质、
12、竞争和盐度等方面的特性,与陆生真菌相比形成了特定的次级代谢途径,能产生丰富的新活性天然产物2 ,这些新颖结构次生代谢物在药物发现过程中发挥着重要作用3,4曲霉属真菌是地球上分布最广泛的真菌群之一,包含约30 0 350 多种真菌5。目前从曲霉属真菌中发现了多种结构类型的次生代谢产物,如生物碱类、类、木质素类、笛体、聚酮类、环肽类等,且具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、抗病毒等多种生物活性6 。土曲霉广泛存在于自然界中,常被从土壤的根际7 、腐烂的有机物8 和海洋环境9 中分离出来,除能够产生降脂药洛伐他汀及其中间体外,土曲霉还能产生多种具有经济意义的次生代谢物。同一种菌,因来源不同,所处环境不同,其次生
13、代谢产物亦不相同。本研究选取来源于南沙群岛海域海泥中分离得到的一株土曲霉为研究对象,并采用大米固体培养基进行大规模发酵,对其次生代谢产物进行分离纯化和结构鉴定,并进行低氧/复氧诱导的PC12细胞损伤的体外神经保护活性评价,以期发现结构新颖和活性较好的代谢产物,进一步丰富曲霉属真菌的次生代谢产物。1材料与方法1.1仪器和材料质谱数据由Agilent6500Q-TOF质谱仪测定(美国安捷伦科技有限公司);旋光数据由AutopolII型自动旋光仪测定(美国鲁道夫公司);核磁数据由BrukerAV-500MHz和AV-600MHz核磁共振仪测定(美国布鲁克仪器有限公司),以TMS作为内标;分析型HPL
14、C为Agilent1260(美国安捷伦科技有限公司);制备型HPLC为EClassicalP3500(大连依利特仪器有限公司);LDZM-60L高压灭菌锅(上海申安仪器有限公司);Enspire多功能酶标仪(美国珀金埃尔默仪器有限公司);IX71荧光显微镜(日本奥林巴斯株式会社);LSM800激光共聚焦(德国卡尔蔡司有限公司);Sephadex LH-20 凝胶(瑞典法玛西亚公司);D101大孔吸附树脂(天津浩聚树脂有限公司);柱层析硅胶2 0 0 30 0 目(青岛海洋化工厂);HS-GF254薄层层析硅胶板(烟台江有硅胶开发有限公司);PC12细胞(批号:CL-0481,武汉普诺赛李思敏等
15、:海洋真菌Aspergillusterreus次生代谢产物研究1733生命科技有限公司);RPMI1640培养基(批号:61870036,美国赛默飞世尔科技有限公司,);Gibco胎牛血清(批号:10 10 0 147,美国赛默飞世尔科技有限公司);CCK-8试剂盒(批号:BA00208,北京博奥森生物技术有限公司);胰酶(批号:2 52 0 0 114,美国赛默飞世尔科技有限公司)。1.2菌种来源菌株土曲霉是从中国南沙群岛海域海泥中分离纯化得到,其DNA扩增和ITS序列由北京擎科生物科技有限公司测定,并经过BLAST对比,发现与菌株 Aspergillus terreus(G e n b a
16、 n k a c c e s s i o n No.MF152908.1)的18 S rRNA序列和ITS序列9 9.31%相似,结合形态学特征,将该菌株鉴定为土曲霉,并保藏于湖南中医药大学附属第一医院医学创新实验中心(编号:CXJ-38)。1.3菌种的发酵与提取分离将目标菌株接种到PDA平板上活化,室温下培养57 d,活化的真菌用刀片切取适量接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中,在室温和150 r/min培养5d后作为种子液。取50 0 mL锥形瓶50 个,每瓶装100g大米和10 0 mL水,于12 1灭菌30 min作为固体发酵培养基。向每瓶固体培养基中加人10 mL种子液,室温下,静置避光培
17、养30 d。固体发酵物用乙酸乙酯提取3次,减压浓缩得浸膏7 1%。浸膏用大孔吸附树脂(D101)分段,分别用水、8 0%甲醇水、甲醇洗脱。8 0%甲醇水洗脱部位进一步用硅胶柱分离,分别用石油醚-乙酸乙酯-甲醇洗脱(10:1:0、7:1:0、5:1:0、2:1:0、1:1:0、1:1:0.2),合并后得10 个组分(Fr.AJ)。组分Fr.D通过凝胶柱色谱和半制备液相(40%甲醇水等度洗脱,流速3mL/min)纯化得到化合物5(5.2 mg,tR=18.8 min),6(3.8 mg,tr=21.2 min)、7(4.5 mg,t r=24.0 min)和13(3.6 mg,tr=25.7 mi
18、n)。组分Fr.E通过凝胶柱色谱和半制备液相(2 5%甲醇水等度洗脱,流速3mL/min,进样量为0.1mL,检测器为VWD,检测波长为2 54nm)纯化得到化合物10(2.5mg,tr=10.6 min)、11(3.0 m g,t r =11.6 m i n)、12(3.5m g,t r=13.0 m i n)。组分Fr.F通过凝胶柱色谱和半制备液相(35%甲醇水等度洗脱,流速3mL/min,进样量为0.1mL,检测器为VWD,检测波长为254nm)纯化得到化合物1(3.5mg,tr=18.6min)、3(3.2 mg,tr=23.8 min)和 8(4.3 mg,tR=26.9min)。组
19、分Fr.G通过凝胶柱色谱和半制备液相1734(30%甲醇水等度洗脱,流速3mL/min,进样量为0.1mL,检测器为VWD,检测波长为2 54nm)纯化得到化合物2(3.3mg,tr=19.2 min)、4(2.8 mg,t R=20.5 min)和 9(3.6 mg,t=25.4 min)。1.4神经保护活性评价对化合物113进行低氧/复氧诱导的PC12细胞损伤保护作用的活性评价,取PC12细胞,在37、16 40 培养液、5%CO2培养箱中适应性培养,接种于2 4孔板中,培养2 4h。将PC12细胞进行低氧/复氧处理后(缺氧3h后,复氧同时给药干预2 4h,给药剂量为1 mol/L和0.1
20、mol/L)。PBS轻轻润洗2 次,每孔加人细胞固定液0.3mL,室温固定细胞45min。弃液,用PBS洗2 次,每孔加人0.2 5%Triton-100液0.2 mL,室温处理10 min。弃液,用PBS洗2 次,每孔加人0.2 mLHoechst染色液(1:400),室温浸染细胞15min。弃液,PBS洗涤细胞3次,于激光共聚焦显微镜下观察细胞凋亡情况。通过CCK-8法检测细胞存活率,向每孔加入10 LCCK-8溶液,混合均匀,在37 孵育3 h,采用酶标仪检测各组细胞在450 nm下的吸光度。1.5丝统计学分析采用SPSS21.0软件进行数据处理,采用t检验确定显著性水平,若P0.05则
21、具有统计学意义。2实验结果2.1结构鉴定化合物1白色粉末;+30.0(c 0.10,MeOH);HR-ESI-MS:m/z 425.155 4 M+H*,分子式为 C24 H24 O7;H NMR(600 MHz,CD,OD)8:7.59(2H,d,J=8.8 Hz,H-2/H-6),6.87(2H,d,J=8.8 Hz,H-3/H-5),6.54(1H,dd,J=8.0,2.2Hz,H-6),6.49(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.42(1H,d,J=2.1 Hz,H-2),5.06(1H,m,H-8),3.77(3H,s,5-0CH,),3.42(2H,q,J=14.7 Hz,
22、H-6),3.08(2H,m,H-7),1.66(3H,s,H-10),1.57(3H,s,H-11);13 C NMR(150 MHz,CD,OD):170.5(s,C-1),139.9(s,C-2),128.4(s,C-3),86.8(s,C-4),171.6 s.(s,C-5),39.6(t,C-6),123.2(s,C-1),130.3(d,C-2/C-6),116.6(d,C-3/C-5),159.2(s,C-4),125.0(s,C-1),132.4(d,C-2),129.0(s,C-3),155.0(s,C-4),115.0(d,C-5),129.7(d,C-6),28.7(t,
23、C-7),123.5(d,C-8),133.0(s,C-9),25.9(q,C-10),17.8(q,C-11),53.8(q,5-0CH,)。以上数据与文献10)1报道基本一天然产物研究与开发致,因此鉴定化合物为丁内酯I。化合物2 白色粉末;5+45.0(c 0.10,Me0H);HR-ESI-MS:m/z 367.153 9M +H *,分子式为 C2 H2Os;H NMR(50 0 M H z,CD,O D)8:7.57(2H,d,J=8.7 Hz,H-2/H-6),6.88(2H,d,J=8.7 Hz,H-3/H-5),6.62(1H,dd,J=8.1,2.3Hz,H-6),6.54(
24、1H,d,J=8.3 Hz,H-5),6.52(1H,d,J=2.3 Hz,H-2),5.16(1H,m,H-8),3.20(1H,dd,J=14.7,3.7 Hz,H,-5),3.14(2H,m,H-7),2.89(1H,dd,J=14.7,4.7 Hz,H,-5),1.69(3H,s,H-10),1.63(3H,s,H-11);3 C NMR(125MHz,CD,OD)8:172.2(s,C-1),138.4(s,C-2),131.1(s,C-3),80.2(d,C-4),39.3(t,C-5),123.9(s,C-1),130.3(d,C-2/C-6),116.6(d,C-3/C-5),
25、159.2(s,C-4),126.5(s,C-1),132.1(d,C-2),128.6(s,C-3),154.9(s,C-4),115.2(d,C-5),129.2(d,C-6),28.9(t,C-7),123.9(d,C-8),132.8(s,C-9),26.0(q,C-10),17.8(q,C-11)。以上数据与文献 报道基本一致,因此鉴定化合物为 3-hydroxy-5-4-hydroxy-3-(3-methyl-2-buten-1-yl)phenyl J methyl J-4-(4-hydroxyphenyl)-2(5H)-furanone。化合物3白色粉末;HR-ESI-MS:m/
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