常用电泳技术.ppt
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1、姓 名:高源专 业:生物化工学 号:201420709电泳技术电泳技术1Contents 简介及发展过程简介及发展过程1234电泳的原理电泳的原理影响电泳分离的主要因素影响电泳分离的主要因素常用的电泳介绍常用的电泳介绍21.1.简介及发展过程简介及发展过程 电泳可以定义为带电的胶体粒子或大分子在外加直流电场中向带相反电荷的电极做定向移动的现象。带正电荷的粒子向负极移动,带负电荷的粒子向正极移动。电泳分离则是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别来进行分离的一种方法。l电泳技术:电泳技术:3l最早发现于最早发现于1808年。俄国物理学家年。俄国物理学家Pehce于于1809年在湿年在湿黏土中插上带玻
2、璃管的正负极两个电极,加压后发现正极黏土中插上带玻璃管的正负极两个电极,加压后发现正极玻璃管中原有的水层变浑浊,即带负电荷的黏土颗粒向正玻璃管中原有的水层变浑浊,即带负电荷的黏土颗粒向正极移动,这就是电泳现象。极移动,这就是电泳现象。l在在1937年由瑞典科学家年由瑞典科学家A.tiselius利用利用U形玻管进行血清形玻管进行血清蛋白电泳,以界面折光率差别分离蛋白。蛋白电泳,以界面折光率差别分离蛋白。l1948年年 Wieland等发明以滤纸作为支持物,使电泳技术等发明以滤纸作为支持物,使电泳技术大为简化。大为简化。l 电泳作为一种生化分离手段已广泛应用于生物大分子的电泳作为一种生化分离手段
3、已广泛应用于生物大分子的分离、纯化、分析、制备以及用于测定它们的分子量、等分离、纯化、分析、制备以及用于测定它们的分子量、等电点等。已成为生命科学、医学、制药学、食品、生物工电点等。已成为生命科学、医学、制药学、食品、生物工程、环境工程等领域常用的实验手段。程、环境工程等领域常用的实验手段。42.电泳的原理5u带有电荷生物分子在电场作用下发生移动带有电荷生物分子在电场作用下发生移动;u由于混合物各组分所带电荷性质,数量以及由于混合物各组分所带电荷性质,数量以及 分子量各不同,在同一电场作用下,各组分子量各不同,在同一电场作用下,各组 分的泳动方向和速度也各有差异分的泳动方向和速度也各有差异;u
4、在一定时间内,他们移动距离不同,从而可在一定时间内,他们移动距离不同,从而可 达到分离鉴定的目的。达到分离鉴定的目的。61.蛋白质的电荷来源蛋白质的电荷来源从电泳的角度来看,蛋白质分子最主要的特性就是它的带电行为:从电泳的角度来看,蛋白质分子最主要的特性就是它的带电行为:等电点(等电点(pI):在某一条件的):在某一条件的PH下,蛋白质所带的正负电荷数相等。下,蛋白质所带的正负电荷数相等。即净电荷为零。即净电荷为零。当体系:当体系:pHpI,蛋白质分子会解离出,蛋白质分子会解离出 而带负电,向阳极移动;而带负电,向阳极移动;当体系:当体系:pHpI,蛋白质分子会结合,蛋白质分子会结合 而带正电
5、,向阴极移动;而带正电,向阴极移动;特定蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成,是一个物理化学常特定蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成,是一个物理化学常数。对于不同的蛋白质,其等电点范围很宽,在一定的数。对于不同的蛋白质,其等电点范围很宽,在一定的PH下,不同蛋下,不同蛋白质分子所带电荷的电性和电量不同,由此可进行蛋白质的分离和分白质分子所带电荷的电性和电量不同,由此可进行蛋白质的分离和分析。析。pHpI72.迁移率迁移率 在一定的在一定的PH条件下,蛋白质分子会解离而带电,带电的性质和电荷条件下,蛋白质分子会解离而带电,带电的性质和电荷密度取决于蛋白质分子的性质和溶液的密度取决于蛋白质分子的性质
6、和溶液的PH。不同的带点颗粒在同一电场。不同的带点颗粒在同一电场的运动速度不同,可以用迁移率来表示。的运动速度不同,可以用迁移率来表示。迁移率(迁移率(m,mobility)即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度:)即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度:m-迁移率,迁移率,;v-迁移速度,迁移速度,cm/s;E-电场强度电场强度,V/cm;d-迁移距离迁移距离,cm;t-电泳时间,电泳时间,s;U-电压,电压,V;l-凝胶长度,凝胶长度,cm。8当球形分子在电场中以恒定速率移动时,所受的动力和阻力当球形分子在电场中以恒定速率移动时,所受的动力和阻力平衡,即:平衡,即:(Stoke定律)定律)Q-
7、被分离分子所带净电荷;被分离分子所带净电荷;-介质黏度;介质黏度;r-分子半径。分子半径。于是有:于是有:即:蛋白质的迁移率与带电颗粒的分子大小、介质的黏度、颗粒即:蛋白质的迁移率与带电颗粒的分子大小、介质的黏度、颗粒所带的电荷有关。所带的电荷有关。一般来说,所带净电荷越多,颗粒越小,越接近球形,则在电场一般来说,所带净电荷越多,颗粒越小,越接近球形,则在电场中迁移速率越快,反之越慢。中迁移速率越快,反之越慢。9对于两种蛋白质来讲,物质对于两种蛋白质来讲,物质A和和B:当使用同一介质分离两种物质时:当使用同一介质分离两种物质时:物质物质A在电场中移动的距离在电场中移动的距离:dA=mA Et
8、某物质某物质B在电场中移动的距离:在电场中移动的距离:dB=mB Et 两物质移动距离差为:两物质移动距离差为:d=(dA-dB)=(mA-mB)Et 若若mA=mB 则则d=0 两种物质不能分离两种物质不能分离 若若mA mB 则则d0 两种物质能分离两种物质能分离结论:不同蛋白质的结论:不同蛋白质的m不同,蛋白质就能够分离开来,蛋白质电不同,蛋白质就能够分离开来,蛋白质电泳正是根据此原理对不同物质进行分离的。泳正是根据此原理对不同物质进行分离的。3.影响电泳分离的主要因素10 内在因素:内在因素:蛋白质分子蛋白质分子本身的性质本身的性质12 电场强度电场强度E溶液的性质溶液的性质3其他其他
9、41.蛋白质的性质蛋白质的性质 蛋白质分子的氨基酸组成决定其在某个蛋白质分子的氨基酸组成决定其在某个PH条件下的电性和电条件下的电性和电量,进而决定了它的电泳速度;蛋白质分子的形状和大小也影响量,进而决定了它的电泳速度;蛋白质分子的形状和大小也影响它的电泳速度。它的电泳速度。2.电场强度电场强度 电场强度电场强度(Electric field intensity)是指每厘米的电位降。是指每厘米的电位降。电场强度对电泳速度起着正比作用,越大则带电颗粒迁移越快,电场强度对电泳速度起着正比作用,越大则带电颗粒迁移越快,电泳时间越短(高压电泳);反之迁移慢,电泳时间长(常压电电泳时间越短(高压电泳);
10、反之迁移慢,电泳时间长(常压电泳)。泳)。3.溶液的性质溶液的性质(1)溶液的)溶液的PH 决定带点颗粒的电性和电量,对于氨基酸或蛋白质等两性电解决定带点颗粒的电性和电量,对于氨基酸或蛋白质等两性电解质来说,溶液的质来说,溶液的pH值离其等电点越远,其净电荷量就越大,迁移速值离其等电点越远,其净电荷量就越大,迁移速度加快。因此需选择合适的度加快。因此需选择合适的pH,使欲分离的各种蛋白质所带电荷的,使欲分离的各种蛋白质所带电荷的电性相同但是电量有较大的差异,以利于分离。电性相同但是电量有较大的差异,以利于分离。(2)溶液的离子强度)溶液的离子强度 离子强度越低,欲分离组分的迁移速度越快;但离子
11、强度太低离子强度越低,欲分离组分的迁移速度越快;但离子强度太低则缓冲能力太小。合适的离子强度范围在则缓冲能力太小。合适的离子强度范围在0.02-0.2mol/L之间。之间。(3)溶液的黏度)溶液的黏度 电泳迁移率与溶液的黏度成反比,所以黏度不能过大或过小。电泳迁移率与溶液的黏度成反比,所以黏度不能过大或过小。4.其他因素其他因素(1)电渗现象)电渗现象 在电场中液体(通常指水)对固体支持物的相对移动。在电场中液体(通常指水)对固体支持物的相对移动。电渗是由于电泳支持介质上含有带电基团,从而吸附流动相向电渗是由于电泳支持介质上含有带电基团,从而吸附流动相向正极或负极移动。电泳时,带电颗粒的迁移速
12、度是颗粒本身的迁移正极或负极移动。电泳时,带电颗粒的迁移速度是颗粒本身的迁移速度与由于电渗携带颗粒的移动速度之矢量和。为消除电渗现象,速度与由于电渗携带颗粒的移动速度之矢量和。为消除电渗现象,可选择无电渗的电泳介质。可选择无电渗的电泳介质。(2)电泳的支持介质)电泳的支持介质 要求介质均匀,对样品吸附力小。吸附会延缓电泳分离。要求介质均匀,对样品吸附力小。吸附会延缓电泳分离。(3)温度)温度 电泳过程中会产热,造成样品的扩散及烧胶。因此需控制电压电泳过程中会产热,造成样品的扩散及烧胶。因此需控制电压或电流,或安装冷却系统。或电流,或安装冷却系统。按分离按分离原理原理移界移界电泳泳区区带电泳泳稳
13、态电泳泳有无固有无固体支持体支持物物自由自由电泳泳支持物支持物电泳泳电泳 电泳分类电泳分类010203聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)等电聚焦(IEF)常用的几种电泳介绍04双向电泳(2D)1.聚丙烯酰胺凝胶电泳l聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质分离与分析中最聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质分离与分析中最常用的电泳方法,包括常规聚丙烯酰胺凝胶电泳常用的电泳方法,包括常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和)和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。)。l聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳(polyacrylamide gel elect
14、rophoresis(polyacrylamide gel electrophoresis,简称,简称,简称,简称PAGE)PAGE)是是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。泳方法。l聚丙烯酰胺凝胶是聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺由丙烯酰胺单体单体(acrylamide)(acrylamide)和交联剂和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(N(N,N N-methylenemethylene-bisacylamide)bisacylamide)在在催化催化剂作用下合成的。剂作用下合成的。PAGEl电泳原理电泳原理 在凝胶中存在凝胶层、缓冲液、在凝
15、胶中存在凝胶层、缓冲液、pH值及电场强度的值及电场强度的不连续性不连续性。大孔径,样品在其中浓缩,在与分离胶的界面上形成薄层,大孔径,样品在其中浓缩,在与分离胶的界面上形成薄层,只具有电荷效应。只具有电荷效应。小孔径,具有电荷效应和分子筛效应,达到分离的目的。小孔径,具有电荷效应和分子筛效应,达到分离的目的。1.电荷效应电荷效应 pI不同,在恒定缓冲系统中不同蛋白质间同性净不同,在恒定缓冲系统中不同蛋白质间同性净电荷的差异。电荷的差异。2.分子筛效应分子筛效应 蛋白质分子的大小和形状的差异;蛋白质通过一蛋白质分子的大小和形状的差异;蛋白质通过一定的分离胶时,受阻滞程度不同而表现出不同的迁移定的
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