T∕CIFST 020-2024 食品用菌种检验 鼠李糖乳酪杆菌检验 PMA-qPCR法.pdf
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1、前 言本文件按照G B/T 1.12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则 的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国食品科学技术学会提出并归口。本文件起草单位:中国食品发酵工业研究院有限公司、国家食品安全风险评估中心、汤臣倍健股份有限公司、山西大学、发酵行业生产力促进中心、丹尼斯克(中国)有限公司、内蒙古伊利实业集团股份有限公司、内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司、光明乳业股份有限公司、北京科拓恒通生物技术股份有限公司、微康益生菌(苏州)股份有限公司。本文件主要起草人:姚粟、郭立峥、徐进、赵溪、迮晓雷、张国华
2、、刘艺茹、冯会粉、葛媛媛、郭茸凯、路春霞、马霞、王玉琼、张旭光、毛跃建、张锋华、马杰、方曙光、夏九学。T/C I F S T 0 2 02 0 2 4食品用菌种检验 鼠李糖乳酪杆菌检验PMA-q P C R法1 范围本文件规定了食品中鼠李糖乳酪杆菌(L a c t i c a s e i b a c i l l u s r h a m n o s u s)的PMA-q P C R检验方法。本文件适用于食品原料和固体饮料中鼠李糖乳酪杆菌的活菌定量检验。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期
3、的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B 4 7 8 9.3 52 0 2 3 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3 术语、定义和缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1实时荧光定量P C R q u a n t i t a t i v e r e a l-t i m e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用
4、荧光信号积累实时监测整个P C R进程,对未知模板D NA进行定量分析的方法。3.1.2C t值 c y c l e t h r e s h o l d v a l u e实时荧光定量P C R反应中每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件。C F U:菌落形成单位(c o l o n y f o r m i n g u n i t s)D NA:脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d)L E D:发光二极管(l i g h t e m i t t i n g d i o d e)O D:光密
5、度(o p t i c a l d e n s i t y)P C R:聚合酶链式反应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n)PMA:叠氮溴化丙锭(p r o p i d i u m m o n o a z i d e)q P C R:实时荧光定量P C R(q u a n t i t a t i v e r e a l-t i m e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n)R O X:一种荧光染料(c a r b o x y-X-r h o d m i n e)1T/C I F S T
6、 0 2 02 0 2 44 原理PMA是一种能与D NA结合的光反应染料,可透过受损细胞膜与菌体D NA发生共价交联,从而抑制受损菌体D NA的q P C R扩增。样品经PMA染料处理、D NA提取后,采用鼠李糖乳酪杆菌特异性引物进行q P C R扩增。细胞膜结构完整的活菌菌体D NA在q P C R扩增反应中能够产生荧光信号。当扩增产物的荧光信号达到设定阈值时,可被实时检测并生成C t值,将C t值代入标准曲线方程中,计算获得样品中鼠李糖乳酪杆菌的活菌数量。5 仪器设备5.1 实时荧光定量P C R仪。5.2 高速台式冷冻离心机:02 0 0 0 0 r/m i n。5.3 酶标仪。5.4
7、 恒温培养箱:3 6 1。5.5 生物安全柜或超净工作台。5.6 冰箱:2 5、-3 0-2 0。5.7 涡旋振荡仪。5.8 L E D光解仪:最大功率6 0 W,频率5 0 H z 6 0 H z,L E D输出波长4 6 5 n m4 7 5 n m。5.9 珠式样品研磨器:速度0.8 m/s 8 m/s。5.1 0 拍打式均质器。5.1 1 高压灭菌锅。5.1 2 天平:精度0.0 1 g。5.1 3 微量可调移液器及配套吸头:0.5 L1 0 L、1 0 L1 0 0 L、1 0 0 L1 0 0 0 L。6 试剂或材料除特别说明外,仅使用分析纯或生化试剂,实验用水应符合G B/T 6
8、 6 8 2中一级水。6.1 无菌均质袋。6.2 无菌离心管:1.5 m L。6.3 无菌玻璃珠:粒径0.1 mm。6.4 无菌研磨管:2 m L。6.5 荧光定量P C R 8连排管或9 6孔板。6.6 9 6孔细胞培养板。6.7 MR S(M a n R o g o s a S h a r p e)琼脂培养基:见G B 4 7 8 9.3 52 0 2 3附录A中A.2。6.8 PMA溶液:浓度2 0 mm o l/L。6.9 无菌超纯水或无菌双蒸水。6.1 0 0.8 5%无菌生理盐水:见G B 4 7 8 9.3 52 0 2 3附录A中A.8。6.1 1 实时荧光定量P C R混合试
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