谷氨酸通过T1R1_T1R3-ERK1_2通路调节香猪睾丸间质细胞自噬相关基因表达.pdf
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1、6期1829谷氨酸通过T1R1/T1R3-ERK1/2通路调节香猪睾丸间质细胞自噬相关基因表达王涵,徐永健,蒙利洁,龚婷*(贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室,贵州贵阳550025)摘要:【目的】探究L-谷氨酸刺激对香猪睾丸间质细胞自噬的影响,为进一步研究味觉受体T1R1/T1R3通过雷帕霉素靶蛋白(mTOR)调控下自噬对雄性生殖的影响提供理论依据。【方法】选取30日龄的健康从江香猪分离培养睾丸间质细胞,采用不同浓度L-谷氨酸刺激睾丸间质细胞T1R1/T1R3,探究激活T1R1/T1R3对睾丸间质细胞自噬相关基因(TAS1R1、
2、TAS1R3、ERK1、ERK2、mTOR、Beclin 1和MAP1LC3B)表达的影响。【结果】从江香猪睾丸间质细胞在培养7296 h增殖最快,于培养96 h时达对数生长期。10 mmol/L是L-谷氨酸刺激睾丸间质细胞味觉受体T1R1/T1R3的有效浓度。经10 mmol/L的L-谷氨酸刺激后,睾丸间质细胞的mTOR、ERK1和ERK2基因相对表达量极显著高于对照组(P0.01,下同),而Beclin 1基因相对表达量极显著低于对照组,MAP1LC3B基因相对表达量显著低于对照组(P0.05,下同);ERK1/2和p-S6K1蛋白相对表达量显著高于对照组,而Beclin 1蛋白相对表达量
3、显著低于对照组。单丹磺尸酰胺(MDC)染色结果显示,经10 mmol/L的L-谷氨酸刺激后,睾丸间质细胞内的酸性自噬泡荧光强度明显低于对照组,表明胞内自噬受抑制。【结论】10 mmol/L的L-谷氨酸可激活从江香猪睾丸间质细胞T1R1/T1R3,且自噬相关基因TAS1R1、TAS1R3、ERK1、ERK2和mTOR及相关蛋白T1R1、T1R3、ERK1/2、p-S6K1和p-mTOR表达升高,而Beclin 1和MAP1LC3B基因及Beclin 1蛋白表达降低,故推测谷氨酸可通过激活味觉受体T1R1/T1R3参与雄性生殖自噬的负调控。关键词:从江香猪;睾丸间质细胞;味觉受体T1R1/T1R3
4、;自噬;谷氨酸中图分类号:S828.89文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)06-1829-08收稿日期:2022-09-05基金项目:国家自然科学基金项目(31702117);贵州省科学技术项目(黔科合基础 2020 1Y135号,黔科合基础 2018 1404号)通讯作者:龚婷(1990-),https:/orcid.org/0000-0003-3624-7972,博士,副教授,主要从事动物遗传育种与繁殖研究工作,E-mail:第一作者:王涵(1998-),https:/orcid.org/0000-0002-6848-8124,研究方向为动物遗传育种与繁殖,E-mail
5、:南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023,54(6):1829-1836ISSN 2095-1191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.024Glutamate regulating autophagy-related gene expression inLeydig cells of Xiang pig through T1R1/T1R3-ERK1/2 pathwayWANG Han,XU Yong-jian,MENG Li-jie,GONG Ting*(College o
6、fAnimal Science,Guizhou University/Key Laboratory of Plateau MountainAnimal Genetics,Breeding andReproduction,Ministry of Education/Guizhou Key Laboratory ofAnimal Genetics,Breeding and Reproduction,Guiyang,Guizhou 550025,China)Abstract:【Objective】This paper explored the effect of L-glutamate stimul
7、ation on autophagy in Xiang pig Leydigcells,providing a theoretical basis for further research on the effects of taste receptor T1R1/T1R3 on male reproductionunder the regulation of rapamycin target protein(mTOR)through autophagy.【Method】Selecting Leydig cells isolatedand cultured from healthy 30 da
8、ys old Congjiang Xiang pigs,different concentrations of L-glutamate were used to stimu-late Leydig cells T1R1/T1R3,to investigate the effect of activating T1R1/T1R3 on expression of autophagy-related genesof Leydig cell(TAS1R1,TAS1R3,ERK1,ERK2,mTOR,Beclin 1 and MAP1LC3B).【Result】The proliferation of
9、 Leydigcells from Congjiang Xiang pig was the fastest during 72-96 h of cultivation,and reached a logarithmic growth phase at96 h of cultivation.10 mmol/L was the effective concentration of L-glutamate to stimulate the taste receptor T1R1/T1R3 inLeydig cells.After stimulation with 10 mmol/L L-glutam
10、ate,the relative expression levels of mTOR,ERK1,and ERK2genes in Leydig cells were extremely significantly higher than those in the control group(P0.01,the same below).The54卷南 方 农 业 学 报 18300引言【研究意义】在自然界中,哺乳动物可感知酸、甜、鲜、咸、苦等味觉,其中味觉受体第一家族(Tastereceptor 1 family,T1Rs)成员T1R1和T1R3形成的异二聚体可感知鲜味(Yarmolinsky
11、et al.,2009)。已有研究表明,味觉受体T1R1/T1R3符合氨基酸跨膜传递要求(Nelson et al.,2002),T1R1或T1R3缺失均会引起机体对氨基酸的不敏感性(Wauson et al.,2012)。不同动物味觉受体T1R1/T1R3可感知不同种类的氨基酸,如小鼠可感知18种L-谷氨酸,猪可感知包括L-谷氨酸在内的6种氨基酸(Toda et al.,2013)。当味觉受体T1R1/T1R3被不同氨基酸激活后,对机体产生的影响也存在明显差异,L-苯丙氨酸和L-亮氨酸可激活小鼠肠道味觉受体T1R1/T1R3而引起胆囊收缩素分泌,L-半胱氨酸可引起肠蠕动和促进降钙素相关基因肽
12、释放(Kendig et al.,2014),L-谷氨酸或精氨酸可引起钙离子释放和胰岛素分泌(Genog luet al.,2019)。此外,T1R1/T1R3可感知氨基酸激活雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)对下游自噬起负调控作用,而自噬在雄性生殖过程中参与精子的生成及睾酮的合成(魏冬芹等,2021;刘文娇等,2022)。因此,探究氨基酸通过T1R1/T1R3激活mTOR调节下游自噬,可为进一步了解自噬在雄性生殖中的作用机理提供理论依据。【前人研究进展】自噬是一种通过形成双层膜结构对细胞内的蛋白或细胞器进行降解,从而维持细胞稳态的代谢过程,
13、在真核生物体内高度保守(Galluzziand Green,2019),目前研究较多的有mTOR信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine 5-monophos-phate-activated protein kinase,AMPK)信号通路和磷脂酰肌醇-3-磷酸激酶(Phosphoinositide-3-kinase,PI3K)信 号 通 路(Li and Zhang,2019;Wang andZhang,2019)。mTOR作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,包括mTOR复合体1(mTORC1)和mTOR复合体2(mTORC2)。其中,mTORC1参与细胞能量代谢、凋亡和自噬等多种生理功
14、能(Hara et al.,1998)。氨基酸作为重要的刺激物质可被T1R1/T1R3感知并调节mTORC1,而不被转运至细胞内。当mTORC1被激活,一方面可磷酸化p70核糖体S6激酶1(p70ribosomal S6 kinase 1,S6K1)和真核起始因子4E结合蛋白1(4E-binding protein 1,4E-BP1),调节蛋白翻译以促进细胞生长;另一方面,mTORC1可磷酸化unc51样蛋白激酶(unc-51-like kinase 1,ULK1)复合物,抑制自噬的起始(Petherick et al.,2015;Zhou etal.,2016)。Hara等(1998)对酿酒
15、酵母的研究发现,培养基中氨基酸的消耗极大抑制了S6K1活化和4E-BP1磷酸化;Kim等(2002)在人类(Homo sapiens)胚肾细胞中也发现亮氨酸的缺失会抑mTORC1活化,从而快速抑制S6K1和4E-BP1的磷酸化。睾丸间质细胞作为分泌睾酮的重要生殖细胞,其自噬相对活跃,且自噬程度与睾酮合成密切相关,可能是通过自噬来调控胆固醇摄入,进而影响睾酮的合成(Gao etal.,2018;Gong et al.,2021)。【本研究切入点】已有研究表明,味觉受体在睾丸间质细胞中高表达(Gonget al.,2021),且T1Rs被证实在雄性生殖过程(精子发生或生精细胞成熟)中具有调节作用(
16、Meyer etal.,2012),但目前有关氨基酸通过T1R1/T1R3激活mTOR调节下游自噬的研究在雄性生殖上鲜见报道。【拟解决的关键问题】以从江香猪为研究对象,培养其原代睾丸间质细胞并通过L-谷氨酸刺激,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测L-谷氨酸刺激对自噬通路和自噬相关基因的影响,以期为进一步研究T1R1/T1R3通过mTOR调控下自噬对雄性生殖的影响提供理论依据。relative expression levels of Beclin 1 gene were extremely significantly lower than those in the c
17、ontrol group.And the rela-tiveexpressionlevelsofMAP1LC3Bgeneweresignificantlylowerthanthoseinthecontrolgroup(P0.05,thesamebelow).The relative expression levels of ERK1/2 and p-S6K1 proteins were significantly higher than those in the control group,while the relative expression levels of Beclin 1 pro
18、tein were significantly lower than those in the control group.The stai-ning results of dansylcadaverine(MDC)showed that after stimulation with 10 mmol/L L-glutamate,the fluorescenceintensity of acidic autophagic vesicles in Leydig cells was significantly lower than that of the control group,indicati
19、ngthat intracellular autophagy was inhibited.【Conclusion】10 mmol/L of L-glutamate can activate the Leydig cells T1R1/T1R3 of Congjiang Xiang pig,and the expression of autophagy related genes TAS1R1,TAS1R3,ERK1,ERK2 andmTOR,as well as related proteins T1R1,T1R3,ERK1/2,p-S6K1,and p-mTOR increase.Howev
20、er,the expression ofBeclin 1 and MAP1LC3B genes and Beclin 1 protein decrease.Therefore,it is speculated that glutamate can participate inthe negative regulation of male reproductive autophagy by activating taste receptor T1R1/T1R3.Key words:Congjiang Xiang pig;Leydig cell;taste receptor T1R1/T1R3;a
21、utophagy;glutamateFoundation items:National Natural Science Foundation of China(31702117);Guizhou Science and TechnologyProject(QKHJC 2020 1Y135,QKHJC 2018 1404)6期1831王涵等:谷氨酸通过T1R1/T1R3-ERK1/2通路调节香猪睾丸间质细胞自噬相关基因表达1材料与方法1.1试验材料选择3头30日龄的健康从江香公猪,由贵州省绿生源畜牧技术开发有限公司提供。通过手术法采集公猪两侧睾丸,置于含3%双抗的PBS中带回实验室,4 h内分离
22、培养睾丸间质细胞。动物试验由贵州大学动物伦理委员会批准,批准号EAE-GZU-2020-P001。Gibco北美胎牛血清、DMEM/F12细胞培养基、I型胶原酶、TRIzol、RIPA蛋白裂解液及PMSF溶液购自西宝生物科技(上海)股份有限公司;DAPI染液、逆转录试剂盒、EBSS细胞缓冲液、0.25%胰酶、细胞自噬MDC染色试剂盒(G0170)及SYBR Green qPCRMaster Mix购自贵州卓一生物生物科技有限公司。抗体p-mTOR(1 1000稀释)、T1R3(1 1000稀释)、T1R1(1 1000稀释)和-actin(1 5000稀释)购自Affinity Bioscie
23、nce公司;山羊抗兔IgG(1 16000稀释)购自Immunoway公司;3-HSD(1 100稀释)购自Santa Cruz公司。3-HSD染色液配制:A液为1.0 mg氯化硝基四氮唑蓝(NBT)和0.5 mg脱氢表雄酮(DHEA)溶于0.5 mL二甲基亚砜;B液为10.0 mg辅酶I(NAD)溶于9.5 mL的PBS;A液和B液混合后为工作液,4 保存备用。主要仪器设备有PCR扩增仪(C1000 TouchTM)、荧光定量PCR仪(CFX96 Real-time System)及荧光显微镜(Nikon ECLIPSE-Ni+DS-Ri2)。1.2试验方法1.2.1睾丸间质细胞培养与鉴定睾
24、丸间质细胞培养与鉴定参照王维勇(2020)、刘文娇等(2022)的方法,用75%酒精清洗睾丸1次,再以含双抗的PBS清洗23次,在培养皿中用镊子小心剥离睾丸外层的白膜,然后置于4 预冷的75%酒精中消毒23 min,PBS清洗23次后用剪刀剪成肉泥状,经0.1%I型胶原酶稀释后装入50 mL无菌离心管中,加入23倍体积的0.1%I型胶原酶,37 水浴1 h,期间每隔810min晃动1次离心管;然后以含10%胎牛血清的培养基终止胶原酶消化,以200目和400目细胞筛过滤,收集滤液,1000 r/min离心10 min,弃上清液;用不含胎牛血清的DMEM/F12培养液吹散细胞沉淀,800r/min
25、离心8 min,弃上清液;再用含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液重悬细胞沉淀,600 r/min离心5 min,弃上清液;离心结束后以含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养液重悬细胞沉淀,制备细胞悬液并接种于细胞瓶进行扩大培养,4 h后更换培养基。采用间接免疫荧光法鉴定分离培养的睾丸间质细胞纯度,当6孔细胞板中的细胞汇合度达70%80%时,弃培养液,PBS清洗3次,每次35 min;4%多聚甲醛室温固定1520 min,PBS清洗3次;0.35%TritonX-100通透细胞15 min,PBS清洗3次;37 下5%山羊血清溶液封闭40 min,PBS清洗3次;3-HSD-mTO
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