枸杞多糖缓解新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的作用机制研究.pdf
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1、枸杞多糖缓解新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的作用机制研究朱利威,张树暾,焦 震摘要 目的:探讨枸杞多糖(LBP)缓解新生大鼠缺血缺氧性脑损伤(HIBD)的作用机制。方法:选取 100 只 SD 新生大鼠,随机分为假手术组(Sham 组)、模型组(HIBD 组)及 LBP 低剂量组(HIBD+L-LBP 组)、中剂量组(HIBD+M-LBP 组)、高剂量组(HIBD+H-LBP组),每组 20 只。Sham 组大鼠只进行创伤处理;HIBD 组采用 Rice-Vannucci 方法建立大鼠 HIBD 模型;LBP 处理组建立大鼠 HIBD模型后,再用 10、20、40 mg/kg 的 LBP 进行药物处
2、理。为观察高剂量 LBP 对 LPS 激活 Toll 样受体 4(TLR4)/信号转导和转录激活因子 3(STAT3)通路后相关蛋白表达、氧化应激和炎性因子的影响,建立大鼠 HIBD 模型后,用脂多糖(LPS)激活 TLR4/STAT3 通路(HIBD+LPS 组),再用 40 mg/kg 的 LBP 进行处理(HIBD+LPS+H-LBP 组)。通过苏木精-伊红(HE)染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测大鼠损伤脑组织凋亡情况;检测各组大鼠脑组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介
3、素(IL)-1、IL-18、IL-6 水平;采用蛋白免疫印迹法(WesternBlot)检测 Bcl-2、Bax 蛋白以及 TLR4/STAT3 通路相关蛋白表达。结果:与 Sham 组比较,HIBD 组脑组织细胞凋亡率明显升高(P0.05);与 HIBD 组比较,LBP 各剂量组脑组织细胞凋亡率明显降低(P0.05)。与 Sham 组比较,HIBD 组脑组织 SOD 水平降低,MDA、LDH、IL-1、IL-18、IL-6 水平明显升高(P0.05);与 HIBD 组比较,LBP 各剂量组 SOD 水平升高,MDA、LDH、IL-1、IL-18、IL-6水平明显降低(P0.05)。与 Sha
4、m 组比较,HIBD 组脑组织 TLR4/STAT3 通路相关蛋白表达明显升高(P0.05);与 HIBD 组比较,LBP 各剂量组 TLR4/STAT 3通路相关蛋白表达明显降低(P0.05)。与 HIBD 组比较,HIBD+LPS 组脑组织 TLR4/STAT3 通路相关蛋白表达明显升高(P0.05);与 HIBD+LPS 组比较,HIBD+LPS+H-LBP 组 TLR4/STAT3 通路相关蛋白表达明显降低(P0.05)。与HIBD 组比较,HIBD+LPS 组脑组织氧化应激程度和炎性因子水平明显升高(P0.05);与 HIBD+LPS 组比较,HIBD+LPS+H-LBP 组氧化应激
5、程度和炎性因子水平明显降低(P0.05)。结论:LBP 通过抑制 TLR4/STAT3 通路减轻新生大鼠 HIBD。关键词 缺血缺氧性脑损伤;枸杞多糖;细胞凋亡;氧化应激;炎性因子;实验研究d o i:1 0.1 2 1 0 2/j.i s s n.1 6 7 2-1 3 4 9.2 0 2 3.1 7.0 1 1 缺氧缺血性脑病(hypoxia-ischemia brain damage,HIBD)是由于各种围生期因素引起的脑缺氧或缺血而形成的常见脑损伤,主要表现为意识状态及肌张力变化。根据病情变化可分为轻度、中度、重度。轻度、中度表现为兴奋或迟钝,肌张力正常或减低,重度可表现为昏迷、肌张力
6、松软、惊厥频繁等。多伴有严重的后遗症,如脑瘫、癫痫、学习困难等 1-3。枸杞多糖(Lyciumbarbarum polysaccharide,LBP)是 一 种 生 物 活 性 物质,从传统中药枸杞子中提取的一种水溶性多糖,具有生殖系统保护、抗氧化及抗衰老、免疫调节、抗肿瘤、调节血脂和降血糖、抗辐射、神经保护、抗癌等作用 4-5。本实验主要探讨 LBP 通过 Toll 样受体 4(TLR4)/信号转导和转录激活因子 3(STAT3)通路缓解新生大鼠HIBD 的作用机制。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物选取 100 只 SD 新生大鼠,体质量 1822 g,由北京维通利华实验动物技
7、术有限公司提供,动物许可证基金项 目 国 家 十 二 五 重 大 新 药 创 新 科 技 重 大 专 项 课 题(No.2014ZX09201022-010-11)作者单位 鞍山市中心医院(辽宁鞍山 114001)通讯作者 焦震,E-mail:引用信息 朱利威,张树暾,焦震.枸杞多糖缓解新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的作用机制研究 J.中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(17):3165-3169.号:SCXK(京)2017-0022。1.1.2 药物与试剂枸杞多糖购自青海康普生物科技股份有限公司,质量分数为 55%,生产批号:KPGQZ-TQW-13-02;脱氧核糖核苷酸末 端转移酶介 导的
8、缺口末 端 标 记 法(TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒购自杭州四季青生物工程材料有限公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;RIPA 裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒购自美国 Cell Signaling Technology 公司;一抗和二抗购自美国 Thermo 公司。1.2 方法1.2.1 动物分组、模型构建及药物处理 100 只 SD 新生大鼠,随机分为假手术组(Sham
9、组)、模型组(HIBD 组)及 LBP 低剂量组(HIBD+L-LBP 组)、中 剂 量 组(HIBD+M-LBP 组)、高 剂 量 组(HIBD+H-LBP 组),每组 20 只。Sham 组大鼠只进行创伤处理;HIBD 组采用 Rice-Vannucci 方法建立大鼠HIBD 模 型 6;HIBD+L-LBP 组、HIBD+M-LBP 组、HIBD+H-LBP 组建立大鼠 HIBD 模型后,再用 10、20、40 mg/kg 的 LBP 进行药物处理。为观察高剂量 LBP对脂多糖(LPS)激活 TLR4/STAT3 通路后相关蛋白表5613中西医结合心脑血管病杂志2 0 2 3年9月第2
10、1卷第1 7期达、氧化应激和炎性因子的影响,建立大鼠 HIBD 模型后,LPS 激活 TLR4/STAT3 通路(HIBD+LPS 组),再用 40 mg/kg 的 LBP 进行处理(HIBD+LPS+H-LBP组)。1.2.2 苏木精-伊红(HE)染色处死大鼠,取脑组织,制成切片。将脑组织置于二甲苯溶液、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中各浸泡 5 min;磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤 3 次,然后浸入苏木精内染色 35 min,水洗 3060 s;酸水浸润20 s,水洗 3060 s;氨水中浸润 40 s,水洗 3060 s,伊红染液中染色 2 min,清洗并用滤纸吸干多余染液
11、,再滴加适量中性树胶,盖玻片封固,显微镜下观察染色情况并分析。1.2.3 TUNEL 染色取大鼠脑组织切片,依次使用二甲苯和无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇溶液清洗,在 37条件下,用蛋白酶 K 处理 15 min,PBS 清洗。10%中性甲醛固定 2 次,加入末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)缓冲液,孵育 5 min;再加入预热终止液,反应 20 min,滴加过氧化酶标志物抗体,孵育 20 min,加上 3,3-二氨基联苯胺(DAB)显色液,30 min 后用无水乙醇和二甲苯固定,晾干,封片。荧光显微镜下观察染色结果。1.2.4 试剂盒检测氧化应激水平采用 SOD、MDA、LDH 试
12、剂盒检测其氧化应激水平,操作过程按照附带的详细说明书进行。1.2.5 ELISA 检测炎性因子水平ELISA 试剂盒检测白细胞介素(IL)-1、IL-18、IL-6炎性因子水平,实验过程按照试剂盒的说明书严格、逐步进行。1.2.6 蛋白免疫印记法(Western Blot)检测蛋白表达剪碎大鼠脑组织,加入 RIPA 裂解液提取总蛋白。根据 BCA 检测试剂盒测定蛋白浓度,取 40g 蛋白样品上样进行 SDS-PAGE 电泳,转膜后封阻 2 h,加入稀释的 一 抗(Bcl-2、Bax 均 为 1800 稀 释,磷 酸 化STAT3(p-STAT3)/STAT 3、TLR4、磷酸化 p65(p-p
13、65)/p65和肿瘤坏死因子-(TNF-)均为 11 000 稀释),4过夜,加入 12 000 稀释的二抗,室温孵育 2 h,滴加增强型化学发光试剂(ECL)化学发光液显影,在凝胶成像系统中收集图像,使用 Quantity One 软件分析蛋白的相对表达水平。1.3 统计学处理应用 SPSS 21.0 统计学软件进行统计分析。符合正态分布的定量资料以均数标准差(xs)表示,两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用 LSD-t检验。以P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 LBP 对 HIBD 大鼠脑组织损伤的影响与 Sham 组比较,HIBD 组大鼠
14、脑组织细胞凋亡率、Bax 蛋白表达明显升高,Bcl-2 蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P0.05);与 HIBD 组比较,HIBD+L-LBP 组、HIBD+M-LBP 组、HIBD+H-LBP 组大鼠脑组织细胞凋亡率、Bax 蛋白表达明显降低,Bcl-2蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(P0.05)。详见图 1、表 1。图 1 各组脑组织 Bcl-2、Bax 蛋白表达条带图表 1 各组大鼠脑组织细胞凋亡率及 Bcl-2、Bax 蛋白表达比较(xs)组别只数细胞凋亡率(%)Bcl-2 蛋白Bax 蛋白Sham 组203.290.620.650.060.730.11HIBD 组206
15、7.563.580.210.021.370.15HIBD+L-LBP 组2059.325.150.290.031.190.12HIBD+M-LBP 组2043.184.230.370.051.060.08HIBD+H-LBP 组2029.251.870.530.070.830.06F值199.029117.07351.849P0.0010.0010.001 注:HIBD 组与 Sham 组比较,P0.05;与 HIBD 组比较,P0.05。6613CH I N E S EJ OURNA LO FI N T E G R AT I V E ME D I C I N EONC AR D I O-C
16、E R E B ROVA S C U L ARD I S E A S E S e p t e m b e r 2 0 2 3 V o l.2 1 N o.1 72.2 LBP 对 HIBD 大鼠脑组织氧化应激和炎性因子的影响与 Sham 组比较,HIBD 组脑组织 SOD 水平明显降低,MDA、LDH 水平以及 IL-1、IL-18、IL-6 水平明显升高,差异均有统计学意义(P0.05);与 HIBD 组比较,HIBD+L-LBP 组、HIBD+M-LBP 组、HIBD+H-LBP 组大鼠脑组织 SOD 水平明显升高,MDA、LDH、IL-1、IL-18、IL-6 水平明显降低,差异均有统计
17、学意义(P0.05)。详见表 2。表 2 各组大鼠脑组织氧化应激和炎性因子表达比较(xs)组别只数SOD(U/mL)MDA(nmol/L)LDH(U/mL)IL-1(pg/mL)IL-18(pg/mL)IL-6(pg/mL)Sham 组2032.523.352.680.321.270.2628.372.8619.262.1352.383.52HIBD 组207.260.857.250.494.650.75124.528.3795.456.23218.2211.85HIBD+L-LBP 组2012.370.786.180.863.780.3997.656.5481.274.36173.3213.
18、47HIBD+M-LBP 组2019.682.324.750.573.120.2858.283.2547.363.46115.726.76HIBD+H-LBP 组2028.153.593.230.371.870.3437.342.1529.183.2576.324.92F值161.697108.33387.537551.054573.473521.370P0.0010.0010.0010.0010.0010.001 注:HIBD 组与 Sham 组比较,P0.05;与 HIBD 组比较,P0.05。2.3 LBP 对 HIBD 大鼠脑组织 TLR4/STAT3 通路相关蛋白表达的影响 与 Sh
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